DC细胞制备标准操作程序.docx

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DC细胞制备标准操作程序

DC细胞制备标准操作程序

1目的和范围：

1.1目的：

规范DC细胞培养操作流程，保证细胞产品制备的稳定性、均一性。

1.2范围：

适用于实验室细胞培养技术人员DC细胞培养的全过

程。

2原理：

2.1外周血PBMC经细胞因子诱导可分化为DC细胞。

3相关文件：

3.1CIK细胞制备标准操作规程

4记录

4.1DC-CIK细胞制备记录。

5物料：

5.1试剂：

75%酒精，碘伏，生理盐水，淋巴细胞分离液（Ficoll），GT-T551培养基，自体血清，DC因子-1，DC因子-2，肿瘤蛋白等。

5.2仪器设备：

生物安全柜，离心机，水浴锅，二氧化碳细胞培养箱，电动移液枪，10ul移液枪，医用剪刀，医用止血钳，试管架。

5.3耗材：

T25培养瓶（25cm2Flask），T75培养瓶（75cm2Flask）15ml离心管，50ml离心管，5ml移液管，10ml移液管，200ul枪头。

6职责：

6.1细胞培养技术人员应严格按照本规程的规定进行DC细胞培

养操作。

6.2QA负责监督细胞培养技术人员的操作全过程，确保DC细胞培养操作的规范性。

6.3审核人负责保证本规程的审核和全过程准确有效。

7工作程序：

7.1实验前准备：

7.1.1洁净区需经过紫外线照射，连续照射时间不得低于30min.，实验过程中风机始终保持开启状态。

7.1.2生物安全柜需经过开机紫外线照射，连续照射时间不得低于30min。

并且开启生物安全柜玻璃防护窗，待生物安全柜内部气流稳定后，才可使用。

7.1.3将实验所需器械放于物料传递窗进行紫外照射，（器械必须是经过高压灭菌锅消毒灭菌，并且在合格期以内）照射完毕后将器械盒用酒精进行擦拭消毒后，放入生物安全柜中备用。

7.1.4单核细胞分离液（Ficoll），培养基，应提前准备好放入生物安全柜中，以便其回复常温，否则将会影响实验效果。

7.1.5DC因子-1及DC因子-2在使用时置于冰块上方，即用即取，禁止在常温下长期放置。

7.2分离培养

7.2.1按照《CIK细胞制备标准操作程序》所述的方式分离

提取PBMC。

7.2.2接种：

7.2.2.1用GT-T551培养基（加10%自体血清）调整细胞浓度为5~6106/ml，铺入细胞培养瓶中，标记，水平放入37℃，5%CO2细胞培养箱内，若非透气孔培养瓶，应拧松瓶盖一圈。

7.2.2.2-3小时后（拧紧瓶盖），取出，（注意轻拿轻放）经消毒后放入生物安全柜中。

7.2.2.3沿培养瓶反面将细胞悬液全部倒入离心管中。

7.2.2.4用5mlGT-T551培养基（加10%自体血清）刷洗培养瓶，涮洗液也倒入离心管中。

7.2.2.5离心管中细胞悬液做CIK培养（详细步骤参照《CIK细胞制备标准操作程序》）。

7.2.2.6沿原培养瓶反面加入10mlGT-T551培养基（加10%自体血清）。

7.2.2.7加入DC因子-1，分装量10ul/支，每10ml培养基可添加1支（培养基不足10ml时按比例添加）。

7.2.2.8标记，水平放入37℃，5%CO2细胞培养箱培养。

7.3换液：

7.3.1第一次直接加液5ml，换液方式如下：

7.3.1.1准备耗材至生物安全柜：

15ml离心管1个，

GT-T551培养基（加10%自体血清），DC因子-1；

7.3.1.2配制试剂：

参考7.2.2.7步骤。

7.3.1.3从培养箱中取出培养瓶，将离心管中培养基沿反面倒入培养瓶。

7.3.2第二次开始半量换液，换液方式如下：

7.3.2.1按7.3.1.1—7.3.1.2的方式配制预添加量培养基。

7.3.2.2从培养箱中取出培养瓶，用移液管取半量培养基至15ml离心管中。

7.3.2.31200rpm，8min，去上清，加入已配制的培养基，重悬，混匀。

7.3.2.4沿培养瓶反面倒入培养瓶中，转移至CO2细胞

培养箱。

7.424h后添加DC因子-2：

分装10ul/支，每20ml培养基可添加1支（培养基不足20ml时，可按体积比例进行添加）。

7.5DC成熟后（一般约24h），将DC细胞悬液转移至CIK细胞悬液中共培养。

7.5.1核对CIK细胞培养袋信息是否与DC细胞信息相符。

7.5.2按CIK细胞制备标准操作规程（SOP-TC-001）

7.5.1-7.5.3的步骤链接对应CIK细胞培养袋和注射器。

7.5.3轻拍DC细胞培养瓶，使DC细胞完全悬浮，悬液倒入

注射器中或移液管转移至CIK细胞培养瓶中

7.5.4用5-10ml培养基（含10%血清）涮洗培养瓶，并冲洗细胞培养面，涮洗液也倒入注射器中或CIK培养瓶中。

7.5.5移去注射器，拧紧盖子，标记，放入CO2细胞培养箱。

7.5.6填写相关记录，清场。

7.6DC细胞收集回输：

当DC细胞直接用于回输时按以下步骤。

7.6.1复核DC细胞是否与回输计划信息相符。

7.6.2取样本，经酒精擦拭后放入生物安全柜。

7.6.3取50ml离心管，标记，打开离心管管盖。

7.6.4轻拍DC细胞培养瓶，使DC细胞完全悬浮，悬液倒入离心管中。

7.6.5用5-10ml生理盐水涮洗培养瓶，并冲洗细胞培养面，涮洗液也倒入离心管中，1200rpm，8min。

7.6.6去上清，加入45ml生理盐水重悬，取0.5ml中间层细胞悬液计数及活率。

7.6.71200rpm，8min，用15ml离心管取15ml上清做内毒素、革兰氏检测并留样，其余上清废弃。

7.6.8用生理盐水和自体血清重悬细胞至20ml（如无自体

血清，用5ml人血白蛋白和15ml生理盐水重悬细胞至20ml）。

7.6.9转袋。

（参照《CIK细胞制备标准操作程序》）

7.6.10用10ml生理盐水涮洗离心管，涮洗液也转入转移袋或生理盐水瓶。

7.6.11填写相关记录，清场。

7.7微生物检测控制点与回输质量控制：

7.7.1细胞接种前取单核细胞最后一次清洗上清2ml液做微生物检测（细菌培养和真菌培养）

7.7.2细胞回输前3-4天取样在培养的细胞悬液2ml做微生物检测（细菌培养和真菌培养）

7.7.3每次回输当日，取细胞上清做内毒素检测，革兰氏染色；待所有质检报告结果已出，质检人员出具细胞合格的质检报告单后，细胞制品方可实验室出库送往治疗室行细胞回输。

8参考文献：

8.1无。

9变更：

修订号

修订原因与内容

执行日期

00

新建

2016.3.1