生物化学常用试剂配制.docx
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生物化学常用试剂配制
常规试剂配制和测定方法
一、溶液的配制
1.Mandels营养盐溶液（1000mL）
名称
重量（g）
硫酸铵（（NH4）2SO4）
14
磷酸二氢钾（KH2PO4）
20
尿素（H2NCONH2）
3
硫酸镁（MgSO4·7H2O）
3
氯化钙（CaCl2·2H2O）
4
注：
用煮沸10min后的蒸馏水配制。
2.Mandels微量元素溶液（1000mL）
名称
重量（g）
氯化钴（CoCl2·6H2O）
3.7
硫酸锌（ZnSO4·7H2O）
1.4
硫酸锰（MnSO4·H2O）
1.6
硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）
5.0
注：
用煮沸10min后的蒸馏水配制。
3.DNS试剂的配制（1000mL）
（1）取：
3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）7.5g
氢氧化钠（NaOH）14.0g
充分溶解于1000mL水中（水预先煮沸10min）
（2）加入：
酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）216.0g
苯酚（在50℃水浴中融化）5.5mL
偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）6.0g
（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后便可使用，平时盛一小瓶（250mL）使用，要放在冰箱中冷藏。
此溶液每月配制一次。
注意：
倒入瓶中时要尽量装满！
！
4.考马斯亮蓝G-250的配制（1000mL）
称考马斯亮蓝G-250100mg即0.1g溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250，4.7%（w/v）乙醇，8.5%（w/v）磷酸。
5.1.0M柠檬酸缓冲溶液的配制（1000mL）
名称
分子量Mn
重量（g）
柠檬酸（C6H8O7·H2O）
210
210
NaOH
40
74.5
准确称取柠檬酸210g，溶于约750mL煮沸（10min）蒸馏水中，待柠檬酸充分溶解后加入氢氧化钠74.5g，完全溶解后将上述溶液转移到1000mL容量瓶中，冷却后将容量瓶定容到1000mL（原始pH4.45）。
（检验方法：
取1.0M柠檬酸缓冲溶液稀释20倍，测定稀释液的pH值，pH值应为4.8）
6.标准糖溶液的配制和标准方程的测定
（1）标准糖溶液的配制
准确称取2.000g葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需105℃烘干3h），蒸馏水溶解，全部转移至1L容量瓶内，摇匀，配制成2g/L葡萄糖/木糖溶液。
取9个100mL容量瓶、1支20mL刻度吸管，分别吸取2g/L葡萄糖/木糖溶液10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。
即为0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L、2.0g/L葡萄糖/木糖标准溶液。
取6个30mL容量瓶、1支20mL刻度吸管，分别吸取2g/L葡萄糖溶液10mL、12mL、14mL、16mL、18mL、20mL依次加入容量瓶，每瓶再加入1.5mL柠檬酸缓冲液，蒸馏水定容，摇匀。
即为1.0g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g酶解葡萄糖。
（2）标准方程的测定：
葡萄糖/木糖标准方程的测定
取10支25mL刻度管，10支1mL刻度吸管，分别加入0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L、2.0g/L葡萄糖/木糖标准溶液1mL，DNS溶液3mL。
100℃煮沸5min，水浴冷却后定容至25mL，摇匀。
以蒸馏水作为空白对照，550nm测定吸光度A。
以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。
（7230型分光光度计输出方程为：
A=MC+N，723型分光光度计输出方程为：
C=KA+B）
酶解木糖标准方程测定（测定木聚糖酶活力）
取6支25mL刻度管，6支2mL刻度吸管，分别加入1.0g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g酶解木糖标准溶液1.5mL，DNS溶液3mL，100℃煮沸5min，水浴冷却后定容至25mL，摇匀。
以蒸馏水作为空白对照，550nm测定吸光度A。
以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。
（7230型分光光度计输出方程为：
A=MC+N，723型分光光度计输出方程为：
C=KA+B）
酶解葡萄糖标准方程测定（测定滤纸酶活力、CMC酶活力）
取6支小试管，6支2mL刻度吸管，分别加入1.0g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g酶解葡萄糖标准溶液1.5mL，DNS溶液3mL，100℃煮沸5min，水浴冷却后，量筒定容至50mL（定容至25mL，测定CMC酶活力），摇匀。
以蒸馏水作为空白对照，550nm测定吸光度A。
以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。
（7230型分光光度计输出方程为：
A=MC+N，723型分光光度计输出方程为：
C=KA+B）
7.柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制
pH
0.1mol/L
柠檬酸/mL
0.2mol/L
磷酸氢二钠/mL
pH
0.1mol/L
柠檬酸/mL
0.2mol/L
磷酸氢二钠/mL
2.2
19.60
0.40
5.2
9.28
10.72
2.4
18.76
1.24
5.4
8.85
11.15
2.6
17.82
2.18
5.6
8.40
11.60
2.8
16.83
3.17
5.8
7.91
12.09
3.0
15.89
4.11
6.0
7.37
12.63
3.2
15.06
4.94
6.2
6.78
13.22
3.4
14.30
5.70
6.4
6.15
13.85
3.6
13.56
6.44
6.6
5.45
14.55
3.8
12.90
7.10
6.8
4.55
15.45
4.0
12.29
7.71
7.0
3.53
16.47
4.2
11.72
8.28
7.2
2.61
17.39
4.4
11.18
8.82
7.4
1.83
18.17
4.6
10.65
9.35
7.6
1.27
18.73
4.8
10.14
9.86
7.8
0.85
19.15
5.0
9.70
10.30
8.0
0.55
19.45
注：
Na2HPO4，Mr=141.98；0.2mol/L溶液为28.40g/L
Na2HPO4·2H2O，Mr=178.05；0.2mol/L溶液为35.61g/L
C6H8O7·H2O，Mr=210.14；0.1mol/L溶液为21.01g/L
二、酶活力的测定
1.滤纸酶活力的测定—纤维素酶的总体酶活力
采用国际理论和应用化学协会（IUPAC）推荐的标准方法测定[Ghose,T.K.,etal,Pure&Appl.Chem.,1987,59,257-268]，一个滤纸酶活力的国际单位（FPIU）等于在标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖量的酶量。
测定方法如下：
取7支试管在其中1#-5#支小试管中加入50mg卷成筒状的滤纸条（1×6cm），适当稀释酶液，取7支试管按下表操作。
（5#有底物无酶，6#为有酶无底物空白对照）
项目
1#
2#
3#
4#
5#
6#
7#
稀释酶液（mL）
0.2
0.3
0.4
0.5
0
0.5
酶解葡萄糖
标样1.5mL
0.05M柠檬酸缓冲液（mL）
1.3
1.2
1.1
1.0
1.5
1
将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50℃下保温60min后立即取出加入3mLDNS试剂，在沸水中反应5min，冷却后加水至50mL并充分摇匀，待滤纸完全沉淀后，取上层清液于550nm波长下测定吸光度A值。
反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。
以0.2、0.3、0.4、0.5mL酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成2mg葡萄糖的酶量，按下式计算样品的滤纸酶活力（FPA）：
滤纸酶活力=2mg葡萄糖
60min×0.18（mg/μmol）×生成2mg葡萄糖的酶量（mL）
一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，单位：
IU/mL。
备注：
当加入0.5mL酶液（指酶液没有被稀释的时候！
）仍无法生成2mg葡萄糖时，按下式计算：
滤纸酶活=0.185×（葡萄糖mg数）
2.β-葡萄糖苷酶活力的测定
方法一：
葡萄糖氧化酶测定法
按国际标准方法测定[Ghose,T.K.,etal,Pure&Appl.Chem.,1987,59,257-268]。
一个β-葡萄糖苷酶活力国际单位（IU/mL）等于标准条件下每分钟转化1μmol底物即生成2μmol葡萄糖的酶量来表示。
预先用0.05M的柠檬酸缓冲液配制15mmol/L的纤维二糖溶液（0.513g纤维二糖/100mL0.05M的柠檬酸缓冲液，现配现用）
（1）每个样品应做三个不同酶量
估计β-葡萄糖苷酶活力（IU/mL）
<0.1
0.1
0.2
0.3
取酶液量（mL）
0.5/0.8/1.0
0.3/0.5/0.8
0.2/0.3/0.5
0.1/0.2/0.3
（2）加料：
试管中加入酶液、缓冲液和纤维二糖溶液如下：
酶液量
（mL）
0.05M柠檬酸缓冲液（mL）
纤维二糖溶液
（mL）
样品
适量
1－酶液
1
酶液空白
1
1
0
纤维二糖空白
0
1
1
每个试管共2mL，用塑料纸包扎好。
注意：
纤维二糖溶液必须用0.05M柠檬酸配制。
（3）酶解反应：
试管置于50℃水浴中，保温30分钟，取出，沸水中放置5分钟使酶失活，冷却至室温。
（4）加显色剂（葡萄糖氧化酶测定试剂）：
取试管中冷却液30µL，加入显色剂3.0mL，混匀；同时做一个葡萄糖标样：
取1g/L葡萄糖标样30µL，加显色剂3.0mL，混匀；置于37℃水浴中，保温15分钟，取出。
（5）测吸光度：
505nm，用蒸馏水调零，测各试管溶液吸光度A值。
1g/L葡萄糖标样的吸光度为0.7左右。
（6）计算产生的葡萄糖mg数：
样品吸光度
测得酶空白所含葡萄糖=2×（mg）
纤维二糖空白1g/L葡萄糖标样吸光度
样品实际产生的葡萄糖=[测得葡萄糖mg]－[纤维二糖空白葡萄糖mg]
－[酶空白葡萄糖mg]×[酶液量mL]（mg）
注：
纤维二糖空白所产生的响应值，当纤维二糖溶液为新鲜配制时，一般很低。
（7）作图：
以log（酶液量mL）为纵坐标，实际产生的葡萄糖mg为横坐标作图，求出生成1mg葡萄糖时对应的酶液量mL。
（8）计算β-葡萄糖苷酶活力：
0.0926
β-葡萄糖苷酶活力=（IU/mL）
生成1mg葡萄糖对应的酶液量（mL）
注：
当加入1mL酶液仍不能生成1mg葡萄糖时，
β-葡萄糖苷酶活力=0.0926×（葡萄糖mg数）
☆补充：
葡萄糖含量测定
采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶终点比色法测定。
葡萄糖测定试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司生产，内含R1（缓冲液）和R2（酶试剂），使用时将R1和R2等量混合。
葡萄糖经葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将4-氨基安替比林与苯酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。
测定该有机化合物的吸光度便能计算出葡萄糖的含量。
测定方法如下：
在测定管中加入30µL待测试样的稀释液（空白管、标准管分别以蒸馏水及1g/L的葡萄糖标准溶液代替），每一试管中加入由R1和R2等量混合的酶酚混合液3.0mL，将各试管分别摇匀，置于37℃水浴中保温15min，冷却至室温后，在7230分光光度计上于505nm下测定吸光度A值，用空白管校正吸光度到零点，葡萄糖含量按下式计算：
葡萄糖含量（g/L）=×稀释倍数
方法二：
采用pNPG（对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷）试剂测定
（1）试剂的配制
50mmol/L,pH4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制（200mL）
方法：
0.1mol/L柠檬酸101.4mL+0.2mol/L磷酸氢二钠98.6mL
1mol/LNa2CO3溶液（250mL）
称取：
26.5gNa2CO3溶解后定容至250mL
5mmol/LpNPG（分子量：
301.25）溶液的配制（100mL）
称取0.1506gpNPG，用50mmol/L，pH4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后定容至100mL。
（2）对硝基苯酚标准方程的测定
对硝基苯酚标准溶液的配制
准确称取0.0209g对硝基苯酚（分子量：
139.11），蒸馏水溶解，全部转移至100mL容量瓶内，摇匀，配制成1.5mmol/L对硝基苯酚溶液。
取6个30mL容量瓶，分别吸取1.5mmol/L对硝基苯酚溶液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。
即为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L。
对硝基苯酚标准方程的测定
取6支15mL刻度管、6支1mL刻度吸管，分别加入0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L对硝基苯酚溶液1.0mL，再加入2.0mL1mol/L的Na2CO3溶液和10mL的蒸馏水，室温放置5min后，摇匀。
以蒸馏水作为空白对照，在400nm下测定吸光度A。
以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。
（3）测定方法
游离酶酶活力的测定：
0.1mL适当稀释的酶液与0.9mL5mmol/LpNPG溶液（分别预热5分钟）混合后，于50℃下保温10min。
10min后立即加入2mL1mol/LNa2CO3溶液终止反应后，再加入10mL的蒸馏水，摇匀。
在400nm下测定吸光度。
以0.1mL蒸馏水代替酶液作空白对照。
（要做2～3个平行样，取平均值）
固定化酶酶活力的测定：
将游离酶酶活的测定方法中0.1mL适当稀释的酶液用0.1mL蒸馏水和一定质量的固定化酶来代替，其余步骤相同。
（4）酶活力的计算
一个β-葡萄糖苷酶酶活力单位定义为：
每分钟水解生成1µmol对硝基苯酚所需要的酶量。
计算公式如下：
游离酶酶活力的计算：
生成对硝基苯酚的量（µmol）
β-葡萄糖苷酶酶活=（IU/mL）
10min×0.1mL
固定化酶活力的计算：
生成对硝基苯酚的量（µmol）
β-葡萄糖苷酶酶活=（IU/g）
10min×称取固定化酶的质量（g）
3.羧甲基纤维素（CMC）—内切葡聚糖酶活力
（1）在25mL刻度试管中加入0.5mL适当稀释的酶液和1.0mL用0.05mol/L柠檬酸缓冲液配制的1%（w/v）羧甲基纤维素悬浮液。
（2）盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50℃下保温30min后立即取出加入3mLDNS试剂，在100℃沸水中煮沸5min，冷却到室温后，加水定容至25mL，充分摇匀后于550nm波长下测定吸光度A值。
（3）反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。
按下式计算CMC酶活力：
CMC酶活力=生成的葡萄糖的量（mg）
30min×0.18（mg/μmol）×0.5mL
一个CMC酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，单位：
IU/mL。
4.木聚糖酶活力的测定
用0.05mol/L柠檬酸缓冲液配制的1%（w/v）桦木木聚糖（Sigma公司制造）溶液。
适当稀释酶液，取7支25mL刻度试管按下表操作（5#有底物无酶、6#为有酶无底物空白对照）。
项目
1#
2#
3#
4#
5#
6#
7#
稀释酶液（mL）
0.2
0.3
0.4
0.5
0
0.5
酶解木糖标样1.5mL
0.05M柠檬酸缓冲液（mL）
0.3
0.2
0.1
0
0.5
1
1%桦木木聚糖（mL）
1
1
1
1
1
0
将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50℃下保温30min后立即取出加入3mLDNS试剂，在沸水中反应5min，冷却到室温后，加水到25mL，充分摇匀后于550nm波长下测定吸光度A值。
根据木糖标准曲线（用木糖的绝对量对吸光度A值作图），找出反应所产生的木糖量（扣除空白值）。
以0.2、0.3、0.4、0.5mL酶量所生成木糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成2mg木糖的酶量，按下式计算木聚糖酶活力：
木聚糖酶活力=2mg木糖
30min×0.15（mg/μmol）×生成2mg木糖的酶量
一个木聚糖酶活力单位定义为每分钟生成1μmol木糖所需的酶量，单位：
IU/mL。
三、木聚糖的测定方法
1、准确吸取5mL搅拌均匀的木聚糖溶液于250mL三角瓶中，加入5mL8%的硫酸，摇匀后用牛皮纸和橡皮筋将三角瓶的瓶口扎住。
2、将三角瓶置于灭菌锅中于121℃条件下保温60min，冷却后取出。
3、将三角瓶中的水解液倒入200mL烧杯中，加入100mL左右的水（注意少量多次洗涤三角瓶），用15%的NaOH溶液中和至pH值为6.5~7.0。
4、将中和液定容到200mL（量筒）。
5、用DNS法测得中和液的还原糖浓度c，则被测样品的木聚糖浓度C为：
C=c×40×0.9
式中：
C—木聚糖浓度，g/L
c—水解液中木糖浓度
0.9—木聚糖和木糖的转化系数
6、每个样品做2个平行样。
注意：
木聚糖的聚合度是用c×40除以木聚糖不水解直接测糖的还原物浓度。
四、可溶性蛋白质的测定
采用Bradford测定方法。
测定试剂采用Bradford试剂（Sigma公司）。
常量分析法。
取5个蛋白质标准样品（分别含牛血清蛋白0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/mL），1个空白对照（蒸馏水）和所有待测试样各0.1mL于10mL具塞试管中，顺试管壁分别加入3.0mLBradford试剂，将试管小心上下翻转几次使液体混合均匀（注意尽量不产生泡沫），在加入染色剂后的5-60min内，于595nm波长下测定各样品的吸光度A值。
以同样处理的空白作为对照。
当蛋白质浓度在0.2-1.0mg/mL范围内时，吸光度A值与蛋白质浓度之间呈线性关系。
作出蛋白质浓度标准曲线后，由待测试样的A值可求得蛋白质的浓度。
微量分析法。
当蛋白质浓度较低时，可采用微量分析法来测定蛋白质浓度。
取5个蛋白质标准样品（分别含牛血清蛋白2、4、6、8和10µg/mL）和待测试样各1.0mL于10mL具塞试管中，顺试管壁分别加入1.0mLBradford试剂，其余步骤与常量分析方法相同。
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