浙江大学-刘振伟教授高级培训班-膜片钳技术数据处理与分析.ppt.ppt

浙江大学-刘振伟教授高级培训班-膜片钳技术数据处理与分析.ppt.ppt

《浙江大学-刘振伟教授高级培训班-膜片钳技术数据处理与分析.ppt.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《浙江大学-刘振伟教授高级培训班-膜片钳技术数据处理与分析.ppt.ppt（139页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

Clampfit10膜片钳实验数据的处理与分析,2014年4月23-25日杭州浙江大学,膜片钳技术高级培训班,刘振伟,一、膜片钳实验数据的处理二、全细胞记录数据的分析三、单通道记录数据的分析四、突触放电活动数据的分析,2,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,内容,3,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,一、基线的调零二、坏点的去除三、滤波四、数据文件内部/之间的数学运算,4,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,一、基线的调零,基线的确认全细胞记录基线易确认，单通道记录基线不易确认。

单通道开放时间较长所记录的时间较短同时开放的通道数目较多且长时间持续开放确定通道电流的方向：

电流方向向上，最负向是基线位置，反之亦然。

如何确定：

膜片两侧液体、钳制电位,5,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,6,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,基线不在零点的原因封接电阻的改变：

漏电流失调电位的存在：

偏移、漂移噪声的干扰：

交流干扰高通滤波的影响：

对记录线的起始部位产生影响,7,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,基线调零方法打开Analyze/Adjust/Baseline

（1）Subtractmeanof（去除均值法）：

适用于去除直流偏移。

（2）Subtractslopeof（去除斜率法）：

适合于去除持续线性漂移。

（3）Subtractfixedvalue（去除固定值法）：

适用于去除直流偏移。

数值有正负之分。

（4）Adjustmanually（手工调零法）：

适合于单通道电流的基线或基线漂移无规律。

8,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,EpochA段,

（1）Subtractmeanof（去除均值法）

（2）Subtractslopeof（去除斜率法）,9,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,（3）Subtractfixedvalue（去除固定值法）（4）Adjustmanually（手工调零法）,10,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,基线调零的注意事项

（1）有些只相对值（如电流幅度的变化值），不需要将基线调零。

但多数情况需要基线调零，建议都要进行基线调零。

（2）对于基线变动复杂的数据，基线调零可能会用到上述的几种方法。

（3）对于某些基线变动，Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。

建议最好在采集数据时就设法调整好基线。

11,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示基线调零方法,12,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,二、坏点的去除,坏点产生的原因刺激伪迹：

给标本施加刺激时产生。

电容瞬变电流：

电容的充放电反应。

瞬时脉冲干扰（Glitch）：

打开电源开关（日光灯、仪器设备开启时）手机来电：

一过性高频。

人手靠近记录探头：

高幅、高频。

膜片钳实验数据的处理,13,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,坏点的赋值

（1）Datavalueatcursor1：

Cursor1的数值。

（2）Meanbetweencursor1.2：

Cursor1-2之间均值。

（3）Meanbetweencursor3.4：

Cursor3-4之间均值。

（4）Straight-linefitbetweencursor1.2：

Cursor1-2之间的直线拟合值。

（5）Fixedvalue（pA/mV）：

输入一个固定的数值。

膜片钳实验数据的处理,14,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示去除坏点,15,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,注意事项

（1）坏点太多时，应在记录前予以去除。

（2）坏点持续时间短，如果出现持续时间较长的坏点，则数据要废弃。

膜片钳实验数据的处理,16,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,三、滤波,信号采集前的滤波全细胞通道电流记录：

1-2kHz全细胞突触活动记录：

10kHz单通道电流记录：

10kHz动作电位记录：

10kHz,膜片钳实验数据的处理,17,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,信号采集后的滤波,膜片钳实验数据的处理,18,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Lowpass,Highpass,Bandpass,Notch,ElectricalInterference,Clampfit滤波类型,膜片钳实验数据的处理,19,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Lowpass最为常用。

Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示在该框底部。

7种类型：

（1）8-poleBessel：

数据失真小，普遍用于时域数据。

（2）Boxcar：

数码滤波器，用于时域数据。

当前数据点及其前后一些数据点（取决于Smoothingpoints，取3-99中的奇数）的平均值赋予当前数据点，完成滤波。

Smoothingpoints值越大，数据幅度削减越大。

（3）Gaussian：

数码滤波器，同Boxcar，但当前数据点在平均值中所占的比例较大。

（4）RC（8-coincident-pole）：

用于时域数据。

（5）RC（single-pole）：

用于时域数据。

（6）8-poleButterworth：

用于频域数据。

（7）8-poleChebyshev：

用于频域数据。

膜片钳实验数据的处理,20,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Lowpass滤波,21,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Highpass又称交流耦合（ACCoupling），可削弱低频信号而通过高频信号。

Clampfit提供两种：

8-poleBessel，单极RC采用-f-3dB，Clampfit自动计算出f-3dB范围并显示在该框底部。

最常见的是在神经元上进行细胞内记录时使用高通滤波器，它可降低膜电位的低频振荡对突触电流的干扰。

膜片钳实验数据的处理,22,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Highpass滤波,23,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Bandpass相当于低通滤波与高通滤波的交叉，需要同时设定高通滤波与低通滤波。

高通滤波的f-3dB不能高于低通滤波的f-3dB。

带通滤波用于欲记录的信号频率较为单一和固定时，对其它频率的噪声进行滤波。

膜片钳实验数据的处理,24,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Notch带阻滤波：

削弱某一特定频率（如50Hz交流）信号。

中心频率（Centerfrequency）：

10-3,000Hz。

频率宽度（3dBwidth）：

频率宽度。

-3dBwidth越窄，滤波需要的数据点越多，滤波效果越好。

膜片钳实验数据的处理,25,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Notch滤波,26,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,ElectricalInterference（EI）电干扰滤波器（Electricalinterferencefilter,EI）为数码滤波器。

可同时去除50Hz及其谐波（100Hz、150Hz等）的复杂交流噪声。

Harmonicsfrom1to：

用于设定欲去除的交流谐波的最高数目，最大数目为20（对应于1kHz），一般去除第1-3个就够了。

Cyclestoaverage：

数目越大，-3dB频率宽度越窄，滤波效果越好，但需时越长。

Referencefrequency：

选50Hz。

膜片钳实验数据的处理,27,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,EI所需最少数据点的计算举例滤波器所需最少数据点（采样频率/50Hz）Cyclestoaverage若采样频率10kHz，则一个50Hz正弦波周期的采样点数10kHz/50200点若设定Cyclestoaverage10，则需要的最少采样点数2,000点采样数据点不够的话，将不能清除谐波干扰。

膜片钳实验数据的处理,28,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,四、数据文件内部/之间的数学运算,Analyze/AverageTraces平均文件内任意几条相同的Trace，获得平均后的一条Trace。

要求：

Clampex软件的Fixed-lengthevents、Episodicstimulation和High-speedoscilloscope模式。

重复记录的信号，时程必须固定不变。

膜片钳实验数据的处理,29,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,降低信号噪声信号频率谱与噪声频率谱一致或有重叠时，滤波不行。

平均Trace的原理：

设有N条Trace，则（见表）：

先累加所有N条Trace，此时信号幅度增大为原来的N倍，而噪声却只增大为原来的N倍。

然后再除以Trace条数N，信号幅度不发生大的变化，而噪声幅度却降低为原来的1/N。

膜片钳实验数据的处理,30,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示AverageTraces功能,31,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Analyze/SegmentedAverage可对几个Trace中的某一相同时段（如EpochA）或Cursor1-2之间的时间段进行平均，平均后的文件通常用于Analyze/SubtractControl功能中的ControlFile。

膜片钳实验数据的处理,32,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Analyze/Arithmetic对文件内的任何Trace进行加减乘除等运算，使原来的Trace得到新值。

如t3=t1+t2，t3=2t1+3t2Results窗口中的该功能可对不同Column的数据进行运算，得到新的Column的数值。

膜片钳实验数据的处理,33,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Analyze/AverageFiles对几个文件进行平均。

例如在进行相同的实验时，需要将几个采样文件相应的每一个Trace进行平均。

平均后的文件会自动生成，文件名为Average000-999.abf。

仅适用于EpisodicStimulation、High-speedoscilloscope模式的数据；Protocol设置必须一致。

同样具有降低噪声的作用。

膜片钳实验数据的处理,34,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示AverageFiles功能,35,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Analyze/SubtractControl两个文件中所有相应的Trace进行相减，可用于去除漏电流或分离某种通道电流。

要求两个文件要采用相同的Protocol来采集（信号数目、Sweep数目与长短、信号单位、采样频率）。

Testfile为“大”文件“被减数”，ControlFile为“小”文件“减数”。

Multiplycontroltracesby:

将ControlFile中的Trace乘以该倍数，然后再从Testfile中减除。

膜片钳实验数据的处理,36,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示SubtractControl功能,37,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,注：

如需要，可用Analyze/DataReduction或Interpolation功能使采样频率变为一致。

若Testfile中的Signal或Sweep数少于Controlfile，后者多余的Signal或Sweep将不被使用。

反之，若Testfile中的Signal或Sweep数大于Controlfile，后者最后一个Signal或Sweep将被反复使用。

若Testfile中的Sweep长度小于Controlfile，后者Sweep中多余的点将不被使用。

反之，若Testfile中的Sweep长度大于Controlfile，后者Sweep中最后一个点将被反复使用。

膜片钳实验数据的处理,以Testfile为准,38,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,Analyze/ConcatenateFiles将在同一条件下获得的数据文件并成一个文件。

同一条件是指相同的采集模式/采样频率/采样时间/信号个数连接后的文件会自动生成:

Concatenate000-999.abf。

膜片钳实验数据的处理,39,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示ConcatenateFiles功能,40,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,一、离子通道的激活曲线二、离子通道的I-V曲线三、离子通道的衰减四、离子通道的失活曲线五、量效曲线,41,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,膜两侧电压差Vm改变，激活离子通道，用激活曲线描述。

反映通道开启的速度及难易程度。

全细胞记录数据的分析,一、离子通道的激活曲线,42,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,给予细胞一系列脉冲电压来记录全细胞电流，作通道的激活曲线：

X轴脉冲电压VmY轴全细胞通道电导g/gmaxBoltzmann方程拟合,全细胞记录数据的分析,43,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,g：

全细胞通道激活电导gmax：

全细胞通道最大激活电导Vm：

不同的去极化（或超极化）脉冲电压V1/2：

通道激活50%时的脉冲电压k：

斜率因子（反映激活速度快慢，k越大，激活速度越慢）,全细胞记录数据的分析,Boltzmann方程,44,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,设：

f（V）=gImax=gmax=1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=0则即为前述的激活曲线方程：

全细胞记录数据的分析,Clampfit中的Boltzmann方程：

Boltzmann,charge-voltage方程,45,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,先对数据进行处理（如基线调零、滤波、选择用于分析的Sweep数目等）。

测量不同去极化脉冲电压下全细胞电流的峰值I（pA）。

计算全细胞电导。

gI/（VmVrev）对全细胞电导g进行标化：

g/gmax，gmax=Imax/（Vm-Vrev）。

作点图最后用激活曲线方程对散点图进行拟合,全细胞记录数据的分析,离子通道激活曲线制作步骤,46,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit演示激活曲线的制作,47,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,几点说明

（1）通过激活曲线的左移或右移以及半失活电压的变化等指标可以判断药物对通道开启过程的影响。

（2）若要反映一类通道的激活特点或对不同组数据进行比较，需要有细胞例数上的要求，要求出平均g/gmax值与标准差，再作激活曲线。

（3）通道反转电位可通过Nernst方程计算出来，也可直接测试出来，后者更准确。

48,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,离子通道电流-电压关系曲线（I-V曲线）：

反映通道：

激活过程、阈电位、反转电位、整流特性给予连续变化的步阶/斜坡脉冲电压Vm（范围大，最好跨越反转电位），测通道电流大小I，作I-V曲线：

X轴VmY轴I药物可影响通道激活或衰减，使I-V曲线形状发生改变。

全细胞记录数据的分析,二、离子通道的I-V曲线,49,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,用Analyze/QuickGraph/I-V作I-V曲线适用于脉冲电压为歩阶（方波）形式的记录数据。

全细胞记录数据的分析,50,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit演示用QuickGraph/I-V作I-V曲线,51,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,注意事项

（1）通道未开放时，电流应该为零。

因此要对基线进行细致的调零，可能要对每个Trace都进行基线调零。

全细胞记录数据的分析,52,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,

（2）若要在一个细胞上测量多次，可选择Clampex中EditProtocol的Run功能，也可用Analyze/AverageFiles功能进行文件间的平均，得到某一个细胞的电流平均幅度值。

全细胞记录数据的分析,53,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,（3）测量同一种类多个细胞的I-V曲线，需要对电流幅度标化。

原因：

细胞大小不同，通道电流幅度不同。

对于一个球形细胞，膜电容Cmd2/100（pF）（d为细胞直径（m））例子：

若细胞直径d=20m，其膜电容Cm=12pF。

电流密度：

I/Cm，I/Cm-V曲线Cm值的获得：

（a）封接过程直接获得（b）OnlineStatistics窗口采集Cm，最后获得平均Cm值I/Imax-V曲线。

全细胞记录数据的分析,54,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,（4）如果从钳制电位开始去极化（或超极化），在I-V曲线上应不包含钳制电位这个数据点。

全细胞记录数据的分析,Vhold=-60mV,55,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,用Analyze/QuickGraph/Tracevs.Trace作I-V曲线适用于脉冲电压为斜坡（Ramp）形式的记录数据。

全细胞记录数据的分析,56,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit演示用QuickGraph/Tracevs.Trace作I-V曲线,57,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,注意事项用

（1）Cursor1、2的位置要放置准确，不要由于放置的误差导致出现错误。

为了更好、更准确地放置Cursor，应该：

（a）在采集时设计好Protocol。

全细胞记录数据的分析,不好,好,58,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,（b）应该以电流线（而不是Waveform电压线）为准设置Cursor。

因为电流线滞后,全细胞记录数据的分析,1,2,2,1,59,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,

（2）可通过选择对话框中的Append，将两条I-V曲线作在一个图中。

全细胞记录数据的分析,60,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,通道在激活因素（一般为去极化）持续存在条件下的失活衰减（Decay）衰减的指标：

（1）时间常数；

（2）10-90%衰减时间。

全细胞记录数据的分析,三、离子通道的衰减,Current,Waveform,61,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,衰减的时间常数通道电流的衰减过程可用单指数方程或者双指数方程拟合，获得衰减的时间常数。

Clampfit软件中“Exponential,standurd”指数拟合方程：

全细胞记录数据的分析,：

衰减的时间常数i=2时，为双指数方程，拟合后获得1和2两个时间常数值。

62,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,全细胞记录数据的分析,Clampfit演示衰减的拟合,63,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,10-90%衰减时间打开Analyze/Statistics窗口，除设置其他选项外，要在Measurement中勾上Risetime,From10To90%。

OK后，在Window/Results窗口中可查看到结果。

全细胞记录数据的分析,64,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,给予细胞膜一个电压刺激，持续一段时间后，开放了的通道会逐渐失活，再给予电压刺激时，失活的通道将不再开放稳态失活（Steady-stateinactivation）。

用失活曲线反映。

全细胞记录数据的分析,四、离子通道的失活曲线,65,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,失活曲线采用双脉冲设置的Protocol来获得数据条件脉冲将膜钳制在不同的电位水平，使相应部分通道处于完全失活状态。

测试脉冲检测未失活通道的电流大小。

X轴条件脉冲的电压数值Y轴测试脉冲的电流大小用Boltzmann方程拟合,全细胞记录数据的分析,66,Patchclamptrainingclass,Apr.23-25,2014,I：

不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的电流大小Imax：

不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的最大电流Vm：

不同条件脉冲电压V1/2：

通道失活50%时的条件脉冲电压k：

斜率因子（