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色谱分析法药物分析长春工业大学
第3章色谱分析法
色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特（M．s．Tswett）分离植物色素时采用。
他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带如图3-1所示，这种方法因此得名为色谱法。
以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义.但仍被人们沿用至今。
1941年以后，马丁（Martin）、辛格（Synge）和詹姆斯（James）等发明了分配色谱的理论和技术成为现代色谱发展的标志。
在此基础上，1956年范第姆特（VanDeemter）等提出的色谱速率理论，以及色谱仪器与色谱固定相的发展使高效液相色谱应运而生。
1980年以后,现代色谱分析的理论和技术日趋成熟，已成为对复杂体系中组分进行分离分析的主要手段，在药物质量标准的制定，药物检查，纯度测定中有着广泛的应用。
图3-1柱色谱分离过程示意图
3.1色谱分析法基础
3.1.1基本概念
1.固定相和流动相在色谱法中，将填入玻璃管、不锈钢管和纸、玻璃、铝制的薄层内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相，不同种类的色谱分析方法有不同的固定相。
自上而下或由下而上的运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相，不同的分析方法有不同的流动相。
2.色谱柱装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）或毛细管称为色谱柱。
3.分配系数各组分在固定相和流动相之间达到平衡时的浓度之比，如公式3-1所示。
（3-1）
Kd--分配系数，q、c---溶质在固相和液相中的浓度
Kd是反应组分保留特性的参数，Kd越大，表明组分与固定相的作用强，易于保留；反之，则组分与固定相的作用弱，易于进入流动相而被洗脱。
由于不同组分其化学性质各异，就具有不同的保留特性或不同的Kd值，从而通过色谱方法得以分离。
4.色谱流出曲线和基本术语
1）基线
在实验操作条件下，组分留出色谱柱后没有组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应是一条与横轴平行的直线。
基线反映了仪器主要是检测器的噪声随时间变化的情况。
2）色谱峰
流出曲线上突出的部分称为色谱峰。
如图3-2色谱图前沿平坦而后沿陡峭的不对称色谱峰称为前延峰3-2
（1）；正常的色谱峰是对称的峰形曲线3-2
（2）；后延拖尾的不对称色谱峰称为拖尾峰3-2（3）。
两种组分在图谱上完全分离，要求这两种组分的色谱峰距离相差足够大，组分色谱峰要窄对称。
（1）峰高或峰面积，用于定量。
（2）峰位（用保留值表示）用于定性。
（3）区域宽度（峰宽）用于衡量柱效。
3）色谱峰区域宽度
色谱峰区域宽度即色谱峰宽度，是色谱流出曲线中的一个重要参数，从组分分离的角度着眼，区域宽度越窄越好。
通常用三种方法表示色谱峰的区域宽度：
（1）标准偏差σ
即正态分布曲线上两拐点距离之半，亦即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。
（2）半峰宽度W1/2又称半峰宽，即峰高一半处色谱峰的宽度。
由于W1/2=2.335σ易于测量，使用方便，所以一般用来表示区域宽度。
（3）峰底宽度F
即通过色谱峰两侧的拐点所作的切线在基线上的截距W=4σ。
4）保留时间（tR）
组分从进样开始到柱后该组分出现峰值浓度时，所需的时间称为保留时间（retentiontime，tR）如图3-2在不同位置有不同的保留时间。
而不保留组分从进样开始到出柱时，所需的时间称为死时间（voidtime，tM）。
图3-2色谱图
5.定量校正因子
色谱定量分析是基于峰面积与组分的量成正比关系。
但同一种物质在不同类型检测器往往有不同的响应灵敏度,同样，不同物质在同一检测器上的响应灵敏度也往往不同，所以两个相等量的物质得不出相等峰面积，或者说，相同的峰面积并不意味着相等物质的量。
因此引入定量校正因子，用校正因子把待测物质的峰面积校正成相当于该标准物质的峰面积，用校正后的峰面积计算待测物质的含量。
它的定义是：
被测物质（i）单位峰面积所相当物质的质量是标准物质（s）单位峰面积所相当物质质量的几倍。
准确称取一定量的被测组分的对照品和标准物质，配成混合溶液。
取一定量的混合液进行色谱分析，测量被测组分的对照品和标准物质的峰面积，按3-2式求出校正因子。
（3-2）
式中Ai为内标物质的峰面积,As为对照品的峰面积,mi为加入内标物质的量,ms为加入对照品的量。
3.1.2色谱法分类
1.按两相状态分类
气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC）根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）。
液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。
超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）。
随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）.
2.按分离机理分类
利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。
利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。
利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。
利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。
最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。
3.按固定相的外型分类
固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。
固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。
4.按照展开程序分类
按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法和迎头法等。
洗脱法也称冲洗法。
工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。
由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同.被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。
这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。
此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。
目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。
顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。
很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。
此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用。
迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。
该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均为非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于对混合物进行分离。
3.2薄层色谱法
薄层色谱法（TLC）是较早应用于中药快速分离和定性分析少量物料的一种非常重要的技术，是目前药典中收载最多的鉴别与有关物质检查方法之一。
在中药的鉴别上，高效TLC的应用使得TLC的分离能力大幅度提高。
TLC是一种快速、灵敏、高效地分离微量物质的方法，是最简单的色谱技术之一，具有操作方便、设备简单价格低廉、分离效率高、专属性好、分析速度快、色谱参数易调整、兼具分离鉴定双重功能等特点，在药物分析中应用广泛。
最近几年围绕着测定过程的标准化和自动化，薄层色谱技术有了全新的发展，扩大了TLC技术在药物定性定量分析中的应用。
薄层色谱法广泛应用于各种天然和合成有机物的分离和鉴定，有时也用于小量物质的精制。
在药品质量控制中，可用来测定药物的纯度和检查降解产物，并可对杂质和降解产物进行限度试验。
在生产上可用于判断反应的终点。
监视反应历程等。
对中成药分析，薄层色谱可用于鉴定有效成分，并进一步进行含量测定。
3.2.1基本概念
1.薄层色谱法（ThinLayerChromatography，TLC）
薄层色谱法是开放型的色谱法。
此法是把吸附剂（或载体）均匀地铺在一块玻璃板、铝箔或塑料板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离，称为薄层色谱法。
2.比移值（Rf）
比移值是表示混合物中各组分在薄层层析中分配吸附的不同导致的位置不同，用式3-3表示
（3-3）
在一定色谱条件下，Rf值为常数，其值在0～1之间．若某组分Rf=0，表示它不随展开剂移动，吸附剂对它的吸附力很强，留在原点不动。
若Rf=l，表示吸附剂对它基本不吸附，随着展开剂到达溶剂前沿。
根据物质的化学结构不同，极性不同，在同一薄板上展开，我们能预测它们的Rf值大小。
3.分离度（Rs）
衡量分离效果的指标可用分离度
表示，其定义为，相邻两斑点的斑点中心至原点的距离之差与两斑点的宽度总和之半的比值，即式3-4所示
（3-4）
式中L1，L2分别为组分1，2斑点从斑点中心至原点距离，W1、W2分别为斑点1、2的宽度。
Rs=1.0时，相邻两斑点基本分开。
图3-3薄层色谱分离度测定示意图
3.2.2基本原理
铺好薄层的玻璃板．称为薄板、薄层或薄层板。
待分离的样品溶液点在薄层的一端，在密闭的容器中用适宜的流动相（展开剂）展开。
由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同，易被吸附的组分移动得慢一些，而较难被吸附的组分移动得快一些。
经过—段时间的展开，不同的物质彼此分开，最后形成互相分离的斑点。
1.特点
1）分离能力强，斑点集中。
2）灵敏度高，几微克．甚至几十纳克的物质也能检出。
3）展开时间短，一般只需十至几十分钟。
1次可以同时展开多个样品。
4）样品预处理简单，对被分离物质性质没有限制。
5）上样量比较大，可点成点，也可点成条状。
6）所用仪器简单，操作方便，用途广泛。
2.分类
按分离机制可分为吸附、分配、离子交换、分子排阻等法。
但应用最多的仍是吸附色谱。
3.2.3薄层色谱法的固定相和流动相
1.固定相薄层色谱法所用的固定相最常用的是硅胶，三氧化二铝等。
粒度要求比柱色谱更细，普通薄层硅胶在40µm左右，展开10～15cm。
高效薄层色谱（HPTLC）硅胶粒度小至l0µm，5µm，展开距离为5cm左右。
薄层色谱展开后的斑点一般都比较集中。
2.流动相一般选用单一或混合的溶剂，极性的一般是水、甲醇、乙醇、醋酸等，非极性的氯仿、苯、环己烷等。
薄层色谱法中选择展开剂的一般规则是极性大的样品需用极性较大的展开剂，极性小的样品用极性小的展开剂。
通常先用单一溶剂展开，根据被分离物质在薄层上的分离效果，进一步考虑改变展开剂的极性。
例如，某物质用氯仿展开时，Rf值太小，甚至停留在原点，则可加入一定量极性大的溶剂如乙醇、丙酮等，根据分离效果适当改变加入的比例，如氯仿一乙醇9：
1，8：
2或7：
3等。
一般希望Rf值在0.2～0.8之间，如果Rf值较大，斑点都在前沿附近，则应加入适量极性小的溶剂（加环己烷，石油醚等）以降低展开剂的极性。
为了寻找适宜的展开剂、往往需要经过多次实验，有时还需要采用两种以上溶剂的混合展开剂。
调节被测组分的Rf值大小，除可改变展开剂的极性外，还可以通过改变板的活度来达到。
一般薄层板的活化温度为l05℃，活化1h，若要降低板的活度，可通过降低板的活化温度如l05℃降为80℃、60℃，均可达到降低板的活度目的，在活度小的板上，吸附剂对各组分的吸附力小，而Rf值会升高。
要求所选择的展开剂，分离几个组分，则组分Rf差值至少大于0．05，Rs大于1，以免斑点重叠。
和吸附往色谱法一样，在选择展开剂时要同时对被测物质的性质，吸附剂的活度及展开剂的极性3方面进行综合考虑。
点样位置不同，而且Rf值不同。
处于边缘的点样点，其Rf值大于中心点。
其原因是由于展开剂在未达饱和的色谱缸内不断地蒸发，蒸发速度从薄层中央到两边缘逐渐增加，使边缘上升的溶剂较中央多，致使近边缘溶质的迁移距离比中心处大，导致边缘的Rf值大。
3.2.4薄层层析操作过程
用薄层色谱法对药物进行定性鉴别，一般包括以下过程点样、展开、斑点检视、鉴别和测定等。
1.薄层板制备：
实验用薄层板，一般的实验室可以用商品吸附剂自制。
常用的规格有：
5cm×20cm、10cm×20cm和20cm×20cm等，薄层板的涂层厚度应在0.2～0.5mm之间。
一般采用湿法制板，即取一定量的吸附剂，用0.1％～0.5％胺甲基纤维素钠（CMC）水溶液调成糊状，以适当的厚度直接均匀地涂于平板上，室温下自然晾干。
使用前于烘箱中活化0.5～1小时。
另外，商品薄层板在使用前也须活化。
2.点样：
常用点样器或定量毛细管进行点样。
一般手工点样要求样品“点”圆正，直径小于3mm，点样量在10PL以下，点样原点线高度为2cm。
在多次点样时应注意，点样不能点成空心圆，不要损伤薄层板面。
目前常用的自动薄层点样器，样品可点成条状。
3.展开：
薄层板应在专用的层析缸中展开。
上行法是最常用的展开方式，即将薄层板倾斜放人盛有展开剂的缸内，如图3-4所示，待展开剂蒸气达到饱和后，展开剂浸没薄层板下端，高度不超过0．5cm。
展开到规定距离后，将薄层摄取出，标记展开剂前沿位置，晾干。
有时需要更换展开剂进行第二次展开。
用过的展开剂不能重复使用。
a双向展开,b上行展开,c近水平展开
图3-4薄层展开示意图
4.斑点检视
1）被测药物自身有颜色，展开后可直接观察斑点的位置，首先在日光下观察，划出有色物质的斑点位置。
2）有些药物自身有荧光展开后可在紫外灯（254nm或365nm）下，观察有无暗斑或荧光斑点强弱。
有荧光的物质或少数有紫外吸收物质可用此法检出。
3）对于自身不具有荧光药物，可在荧光薄层板检测，适用于有紫外吸收的物质。
荧光薄层是在硅胶中掺少量荧光物质，如硅酸锌锰，制成的板，在254nm紫外灯下，整个薄层板呈黄色荧光，被测物质由于吸收了部分照射在此斑点位置的紫外线，而呈现各种颜色的暗斑。
4）既无色，又无紫外吸收的物质可采用显色剂显色。
用硫酸乙醇液显色．大部分有机化合物能显不同颜色的班点。
碘蒸气显色也是有机化合物良好的显色剂。
其它显色剂利用物质的特性反应显色，如氨基酸，可喷茚三酮试剂，多数氨基酸呈紫色，个别氨基酸呈黄色。
对还原性物质，含酚羟基物质，可喷三氯化铁一铁氰化钾试剂。
3.2.4定性分析
对斑点的定性鉴别主要依靠Rf值的测定。
Rf值的测定受很多因素影响，如吸附剂的种类和活度，展开剂的极性，薄层厚度，展开距离，色谱容器内溶剂蒸气的饱和程度等。
因此要与文献记载的Rf值比较。
来鉴定各物质，控制操作完全一致比较困难。
常采用的方法是用已知标准物质作对照。
将样品与标准点在同一块薄层上展开，显色后，根据样品的Rf值及显色过程中的不同现象与标准品对照比较进行定性鉴定。
与紫外光谱用于定性时的情况类似，仅根据一种展开剂展开后得到的Rf值作为定性依据是不够的，需要经过两种以上不同组成的展开剂得到的Rf值与标准品一致时，才可基本认定该斑点与标准品是同一化合物。
将薄层分离得到的单一组分，与红外光谱，核磁共振光谱、质谱等方法联用，可进一步帮助确证。
3.2.5定量分析
1.系统适用性试验
按各品种项下要求对检测方法进行系统适用性试验，使斑点的检测灵敏度、比移值（Rf）和分离效能符合规定。
1）检测灵敏度系指杂质检查时，供试品溶液中被测物质能被检出的最低量。
一般采用对照溶液稀释若干倍的溶液与供试品溶液和对照溶液在规定的色谱条件下，在同一块薄层板上点样、展开、检视，前者应显示清晰的斑点。
2）比移值（Rf）系指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。
鉴别时，可用供试品溶液主斑点与对照品溶液主斑点的比移值进行比较，或用比移值来说明主斑点或杂质斑点的位置。
一般比移值（Rf）应在0.2～0.8之间。
3）分离效能鉴别时，在对照品与结构相似药物的对照品制成混合对照溶液的色谱图中，应显示两个清晰分离的斑点。
考察分离效能可采用下列溶液：
将杂质对照品用供试品自身稀释对照溶液溶解制成混合对照溶液；也可将杂质对照品用待测组分的对照品溶液溶解制成混合对照溶液；或者采用供试品以适当的降解方法获得的溶液。
上述溶液点样展开后的色谱图中，应显示清晰分离的斑点。
2.测定法
1）鉴别可采用与同浓度的对照品溶液，在同一块薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的颜色（或荧光）与位置（Rf）应与对照品溶液的主斑点一致，而且主斑点的大小与颜色的深浅也应大致相同。
或采用供试品溶液与对照品溶液等体积混合，应显示单一、紧密的斑点；或选用与供试品化学结构相似的药物对照品与供试品溶液的主斑点比较，两者Rf应不同，或将上述两种溶液等体积混合，应显示两个清晰分离的斑点。
2）杂质检查可采用杂质对照品法、供试品溶液的自身稀释对照法或杂质对照品法与供试品溶液自身稀释对照法并用。
供试品溶液除主斑点外的其他斑点应与相应的杂质对照品溶液或系列浓度杂质对照品溶液的主斑点比较，或与供试品溶液的自身稀释对照溶液或系列浓度自身稀释对照溶液的主斑点比较，不得更深。
通常应规定杂质的斑点数和单一杂质量，当采用系列自身稀释对照溶液时，也可规定估计的杂质总量。
薄层色谱法的定量分析采用仪器直接测定较为准确，方便。
但一些简易的方法有利于薄层色谱法的推广。
3）目视比较法
将不同量的标准品作为系列，同样品一起分别点在同一块薄层上，展开，显色后，目测比较斑点颜色的深浅和面积大小，求出未知物含量的近似值，作为半定量方法，精密度为±10％。
该法常应用于原料药中杂质的限度检查。
4）洗脱法
样品经薄层分离定位后，将色点部位的吸附剂刮下，用合适溶剂将化合物洗脱后进行测定。
测定方法一般采用分光光度法或比色法。
点样也可点成条状，以增加点样量，以符合测定灵敏度需要。
5）薄层扫描法
用一定波长、一定强度的光束照射薄层上的色点，用仪器测量照射前后光束强度的变化，从而求得化合物的含量。
双波长薄层扫描仪是较常应用的一种仪器，它是适应薄层色谱的要求可以对斑点进行扫描的专用分光光度计。
它的特点是双波长测定及对斑点进行曲折扫描。
可进行反射法，透射光法测定。
常选用反射法。
3.3气相色谱法
气相色谱法（gaschromatographyＧＣ）自２０世纪５０年代问世以来，一直在飞速地发展，并已成为现代仪器分析方法中应用最广泛的一种方法。
这是由其分离效能高、样品用量少、灵敏度高、分析速度快等特点所决定的。
一般填充柱有几千块理论塔板数。
毛细管柱可达一百多万块理论塔板数，这样可以使一些分配系数很接近的以及极为复杂、难以分离的物质，获得满意的分离。
例如用空心毛细管柱，一次可以解决含有一百多个组分的烃类混合物的分离及分析。
在气相色谱分析中，由于使用了高灵敏度的检测器，可以检查10-11～10-13g物质。
因此在痕量分析中，它可以检测药品中残留有机溶剂、农副产品、食品、水质中的农药残留量等，还可用于微量或痕量药物的分离、检测。
目前的色谱仪器，通常都带有微处理机，使色谱操作及数据处理实现了自动化。
气相色谱法可以分析气体试样，也可分析易挥发或可转化为易挥发的液体和固体。
一般地说，只要沸点在500℃以下，热稳定性好，分子量在400以下的物质，原则上都可采用气相色谱法。
目前气相色谱法所能分析的有机物，约占全部有机物（约300万种）的20％。
但对于挥发性小、热稳定性差和极性过大的药物，受样品蒸气压限制是气相色谱法的一大弱点，定性困难是其弱点。
3.3.1基本概念
1．气相色谱法（GC）
是以气体为流动相，固定相可为液体或固体的色谱法。
是一种高效能、高选择性、高灵敏度、操作简单、应用广泛的分析、分离方法。
2.气相色谱法的分类
气相色谱法按固定相的聚集状态不同，分为气固色谱法及气液色谱法。
按分离原理，气固色谱属于吸附色谱，气液色谱属于分配色谱。
按色谱操作形式来分，气相色谱属于柱色谱，按柱的粗细不同，可分为填充柱色谱法及毛细管柱色谱法两种。
填充柱是将固定相填充在金属或玻璃管中（内径0.1～0.5mm）。
毛细管柱可分为开口毛细管柱、填充毛细管柱等。
3.3.2气相色谱分离的原理
气相色谱过程是待测物样品被蒸发为气体并注入色谱分离柱柱顶，以惰性气体（指不与待测物反应的气体，只起运载蒸汽样品的作用，也称载气）将待测物样品蒸汽带入柱内分离。
其分离原理基于待测物在气相和固定相之间的吸附-脱附（气固色谱）和分配（气液色谱）来实现的。
因此可将气相色谱分为气固色谱和气液色谱。
气固色谱是利用不同物质在固体吸附剂上的物理吸附-解吸能力不同实现物质分离。
由于活性（或极性）分子在这些吸附剂上的半永久性滞留（吸附-脱附过程为非线性的），导致色谱峰严重拖尾，因此气固色谱应用有限，只适于较低分子量和低沸点气体组分的分离分析。
气液色谱通常直接称为气相色谱。
它利用待测物在气体流动相和固定在惰性固体表面的液体固定相之间的分配原理实现分离。
试样在色谱柱中分离过程的基本理论包括两方面：
一是试样中各组分在两相间的分配情况，可用塔板理论来描述。
二是各组分在色谱柱中的扩散和运行速度，可用速率理论来描述。
1.塔板理论
分配色谱原理类似于逆流分配法。
把一根色谱柱假想成由无数个分液漏斗组成，样品在色谱柱中则要经过无数次分配，这样分配系数小的组分和分配系数大的组分可分开。
塔板理论把一根色谱柱比作—个蒸馏塔。
色谱柱可由许多假想的塔板组成（即色谱柱可分成许多个小段），在每一小段（塔板）内，一部分空间为涂在载体上的液相占据，另一部分空间充满着载气（气相）。
当欲分离组分随载气进入色谱柱后，就在两相间进行分配。
由于流动相在不断地移动，组分就在这些塔板间隔的气液两相不断地达到分配平衡。
经过多次的分配平衡后，分配系数小的组分先流出色谱柱。
由塔板理论可导出理论塔板数n与色谱峰宽度的关系，如果色谱柱长为Ｌ，虚拟的塔板间距离为Ｈ，色谱柱的理论塔板数为ｎ，则三者的关系为：
ｎ=Ｌ/Ｈ。
单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高，理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
（3-5）
H为理论塔板高度，L为色谱柱长
由上式可以说明，W1/2越小，峰越窄，色谱柱塔板数越多，塔板高度越小，柱效越高。
2.速率理论
塔板理论形象地描述了组分在色谱柱中的分配平衡和分离过程，它在解释色谱流出曲线的形状、保留值以及在计算评价柱效能等方面是成功的。
但它不能解释同一色谱柱在不同载气流速下柱效能不同等实验事实。
虽然在计算理论塔板的公式中包含了色谱峰宽项，但塔板理论本身不能说明为什么色谱峰会变宽，也未能指出哪些因素影响塔板高度，从而未能指明如何才能减少组分在柱中的扩散和提高柱效的方法，其原因是塔板理论没有考虑到各种动力学因素对色谱柱中传质过程的影响。
速率理论在塔板理论的基础上指出，组分在色谱柱中运行的多路径及浓度梯度造成的分子扩散，以及在两相间质量传递不能瞬间实现平衡，是造成色谱峰展宽、使柱效能下降的原因。
1956年荷兰学者vanDeemter等吸取了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合进去，导出了塔板高度只与载气线速度ｕ的关系式：
（3-6）
式中A、B、C为3个常数，其中A称为涡流扩散项，B为纵向扩散系数，C为传质阻抗系数。
下面分别讨论各项的意义。
1）涡流扩散项A
气体碰到填充物颗粒时，不断地改变流动方向，使试样组分在气相中形成类似“涡流”的流动，因而引起色谱峰扩张。
由于填充物填充不均匀，使同一种组分的不同分子经过长度不同的途径流出色谱柱，因此也称为多径扩散项。
见图3-5所示。
图3-5多径扩散示意图
因此使用适当细粒度和颗粒均匀的载体，并尽量填充均匀，是减少涡流扩散，提高柱
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