实验一血液标本提取DNA蛋白酶K酚抽提法.docx

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实验一血液标本提取DNA蛋白酶K酚抽提法

实验一、血液标本提取DNA（蛋白酶K-酚抽提法）

一、实验原理

离心分离到外周血的白细胞层；用细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀即可得到基因组DNA片段。

二、实验步骤：

1、血液标本处理1.0ml抗凝全血（ACD、EDTA抗凝均可）2000rpm离心10min（1.5mlEP管）。

轻轻去上清液（血浆），吸出淡黄色悬浮液（白细胞层）置于另一2.0mlEP管中。

（约50μl）

2、细胞裂解加入10倍体积组织细胞裂解液，37℃1h，

3、加入蛋白酶K消化加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml（约4μl），充分混匀，37℃震荡12-24h或37℃1h后，56℃水浴3h。

保温过程中不时摇动，混匀反应液。

液体逐渐变粘稠，表明已有DNA释放出来，操作应轻柔。

4、酚抽提：

将上述溶液冷却至室温，加等体积的Tris饱和酚（pH8.0）溶液，温和缓慢颠倒离心管10min，混匀两相成乳液。

12000rpm5分钟，两相分层。

用宽口径移液管小心吸出上层粘稠的水相，移至一新的2.0mlEP管中。

（小心一点，不要吸入蛋白层。

如交界处有白色沉淀，需重新抽提有机相，用酚重新抽提两次，合并水相）

5、三氯甲烷/异戊醇抽提上清液加等体积三氯甲烷：

异戊醇（24：

1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上层水相0.5ml入另一新的2.0mlEP管；

6、DNA沉淀上清液中加0.2倍体积3.0mol/L醋酸钠，再加2倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇，充分混匀；应可看到白色絮状物（DNA）。

12000rpm5分钟，弃上清液；

7、纯化：

加1ml70%乙醇洗涤，12000rpm离心5分钟，去上清夜，重复1次；（此过程不得振荡摇动）

8、溶解：

弃上清液后，自然干燥（挥发痕量乙醇）后，用30μlpH8.0TE完全溶解，保存在-20℃备用。

三、注意事项

1、加样准确，操作轻柔；微量加样器绝对不能超过最大量程；

2、加酚试剂时，不要接触到皮肤上，有腐蚀性；如不小心弄到，立即用清水冲洗；

3、取上清液时，不可吸到下层溶液；

4、加TE液后轻摇10min溶解DNA或-4˚C保存待用。

5、一次性用品、废液集中处理。

注意试剂配置中的浓度为终浓度。

四、小结

1、总结实验情况，指出存在的问题

实验二DNA浓度、纯度及完整性的测定

一、实验原理

1、在250~270nm处核酸分子中的碱基有最大吸收.260nm下，吸光值等于1时相当于50μg/ml的dsDNA，40μg/ml的ssDNA或RNA，33μg/ml的寡核苷酸。

2、主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质等的污染。

比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。

DNA纯品:

OD260/OD280=1.8

RNA纯品:

OD260/OD280=2.0（1.8~2.1）

经验：

纯DNA：

OD260/OD280≈1.8（＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：

1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用其他方法进行估算。

3、以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性

基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状

二、实验步骤

1、DNA浓度与纯度的测定：

取10μlDNA样品与2.0ml双蒸水混匀，用0.5CM比色杯在紫外分光光度计上测定A260和A280。

进行计算。

2、DNA完整度电泳：

（1）1%琼脂糖凝胶的制备：

称取0.4g琼脂糖于锥形瓶中，加入40ml0.5xTE液，沸水浴完全溶解，冷却至60℃时加入30μl1mg/ml的EB液混匀，倒入插有梳齿的凝胶制备模板上，厚度约3mm（超过梳齿2mm）。

完全凝固后轻轻取出梳齿。

（2）点样：

将凝固的凝胶轻轻推入装有0.5xTE液的电泳槽中，液面浸没胶面即可。

点样孔朝负极，加5V电压。

取2μl溴酚蓝加样液于塑料膜上，加入5μlDNA样品。

混匀，加入凝胶点样孔中，记录好位置。

（3）电泳：

以8-10V/CM凝胶电泳40min~60min。

（根据溴酚蓝指示剂的位置判断）

（4）结果观察：

用塑料片轻轻取出凝胶放在紫外透射仪中观察。

三、实验结果与计算

1、DNA浓度与纯度

DNA浓度（μg/ml）=A260x50x稀释倍数

DNA纯度=A260/A280

2、DNA电泳作图

四、注意事项

1、各种试剂加量应准确。

2、制胶时需要一次完成，不得断续倒胶和产生气泡。

取出梳齿时不要弄破凝胶孔。

3、先加5V电压可以防止先加样的DNA扩散，加样时不要弄破凝胶孔。

4、注意紫外透射仪的紫外线防护。

5、紫外线照射时间过长会引起DNA荧光强度下降。

五、小结

实验三RNA抽提与测定（TRIZOL法）

一、实验原理

以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相，变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来。

保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备。

二、操作步骤

1、样品处理：

在洁净玻璃试管中加6ml红细胞裂解液，取抗凝全血2.0ml，混匀，室温放置10min。

以4000rpm离心8分钟，去上清，收集底部的细胞。

加1.0ml红细胞裂解液，混匀，移入1.5mlEP管（经处理的）中，3000rpm离心5min，去上清，即得所需细胞。

用移液管加TRIZOL试剂反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，室温放置5分钟以使核蛋白体完全分解。

2．分离阶段（提取）

每1mlTRIZOL加0.2ml三氯甲烷。

盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在室温下孵育2—3分钟。

在4°C12000rpm高速冷冻离心15分钟。

（离心后混合物分成三层：

下层红色的苯酚-三氯甲烷层，中间层白色，上层无色的水相层。

RNA存在于水相层当中。

水相层的容量大约为所加TRIZOL容量的60%。

）

3．RNA的沉淀

将上层水相层转移到另一1.5mlEP管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。

最初均化时的每1mlTRIZOL对应0.5ml异丙醇。

将混合的样品在室温放置10分钟并4°C12000rpm高速冷冻离心10分钟。

RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

4．RNA的洗脱

弃去上清液。

用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，每1ml的TRIZOL加1ml的75%乙醇。

4°C下以不超过7500rpm的冷冻离心5分钟。

5．RNA的再溶解

弃去上清液，室温下挥发掉痕量的乙醇，用30μlDEPC双蒸水溶解RNA，并在55—60°C下孵育10分钟。

6、RNA浓度与纯度的测定：

取10μlRNA样品与2.0ml双蒸水混匀，用1.0CM比色杯在紫外分光光度计上测定A260和A280。

进行计算。

7、RNA完整度检测：

1%琼脂糖凝胶，EB染色，0.5xTE液中的电泳40min（40ml凝胶加30μlEB液；2μl上样液*8μl，电压不超过8V/CM）。

取出凝胶放在紫外透射仪中观察。

三、注意事项

1、在操作中，宜简单干燥RNA沉淀。

尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。

2、TRIZOL试剂有腐蚀性，注意防护。

3、以DNA标准为参照，28S和18S分别位于2.0kb和0.9kb左右。

实验四、质粒DNA提取与分析

一、实验原理

将细菌悬浮于葡萄糖等渗溶液中，经EDTA、NaOH-SDS处理，可破坏细菌细胞壁和细胞外膜，使细胞裂解。

NaOH破坏核酸碱基配对使氢键断裂，细菌染色体DNA和质粒DNA变性，加入乙酸钾后质粒DNA迅速复性为可溶性质粒DNA，小分子RNA也可呈可溶状态，而变性的染色体DNA、大分子RNA以及SDS-蛋白质-细胞膜复合物缠绕着

附着在细胞壁碎片上，冰浴后易沉淀，可离心去除，而质粒DNA及细菌中的可溶性蛋白质、核糖核蛋白体和tRNA等留在上清液中。

通过加入蛋白水解酶和核糖核酸酶可以分解之。

通过碱性酚（pH8.0）或三氯甲烷-异戊醇等有机溶剂去除蛋白质，再用乙醇等沉淀DNA，即可得到纯化的质粒DNA.

二、实验步骤

1、细菌培养：

将含有PET28a质粒的菌种接种到液体培养基中（含卡那霉素50ug/ml），374°C振荡培养过夜至对数生长期备用。

2、收集细菌：

取1.5ml对数生长期的菌体于2.0mlEP管中，离心8000rpm1min，收集菌体；弃上清液，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液；

3、加100ulGTE缓冲液，移液器轻轻吹打，使菌体重新悬浮，放置室温5min。

4、加入200ul新鲜配制的NaOH-SDS溶液，颠倒混匀10次，冰浴5min。

（NaOH-SDS的作用是裂解细胞，NaOH使核酸变性）

5、加入150ul预冷的乙酸钾溶液，充分混匀，冰浴5min；（质粒DNA复性）

6、4°C离心，12000rpm5min，并将上清液移至另一新EP管中（上清液中含质粒DNA，小分子RNA，可溶性蛋白等）

7、加入2ug/ulRnase溶液2ul，37°C30min（Rnase的作用是水解RNA）。

8、加等体积酚：

三氯甲烷抽提一次，离心12000rpm5min，将上清液移至另一新EP管中。

（酚、三氯甲烷的作用是去蛋白质）

9、加等体积酚抽提一次，离心12000rpm5min，将上层水相移至另一新EP管中。

（再次抽提，去蛋白质）

10、加0.6倍体积异丙醇，冰浴30min，离心12000rpm5min，弃上清液。

（沉淀质粒DNA）

11、沉淀用70%乙醇0.5ml洗一次，弃上清液，室温放置10min，挥干乙醇。

12、用30ulTE溶解沉淀的DNA，4°C保存。

13、用紫外分光光度计测定浓度及纯度。

三、注意事项

1、抽提过程尽量保持低温。

2、沉淀DNA通常用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长，可使DNA沉淀完全。

3、PET28a分子量5369bp，含有卡那霉素抗性基因。

4、三氯甲烷可使蛋白质变性并有助于液相和有机相分离。

酚和三氯甲烷均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

四、小结：

实验五：

PCR定性检测乙肝病毒DNA

一、实验原理

PCR是在模板、引物、4种dNTPs和耐热聚合酶存在的条件下，特异性扩增位于两段已知序列之间DNA片段的酶促合成反应，并对扩增反映的终产物进行定性及定量分析。

本实验采用达安基因公司生产的乙肝定性PCR试剂盒，检测临床标本中是否存在乙肝病毒。

扩增产物长度为327bp。

二、实验步骤

1、样品处理：

将100ul待测血清或血浆加入到样本提取管中，沸水浴10min，12000rpm离心10min。

2、加样：

取上清液5ul加入融化后的反应管中，盖紧PCR反应管管盖，并做好相应记录。

在2000rpm离心10s。

3、PCR上机扩增：

将反应管放入PCR仪中，盖紧上盖。

设置反应程序。

95°C5min；95°C1min，55°C35s,72°C45s,32cycle;72°C5min。

约需要2.5小时。

4、结果观察：

扩增结束后，通过1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外投射仪或凝胶成像系统下观察。

5、扩增过程中讲解荧光定量PCR的原理与结果分析。

三、注意事项

1、反应管中含有引物、4种dNTPs和耐热聚合酶及缓冲液等反应所需的条件，使用前应放置至室温融化后，并在2000rpm离心10s。

2、戴手套操作；EB有致癌作用。

3、务必弄懂PCR反应体系的组成以及扩增程序中每个步骤的意义。

四、实验小结

实验六临床基因扩增实验室见习

一、实验目的

1、掌握临床基因扩增实验室设置的条件与要求；

2、熟悉临床基因扩增实验室质量控制的方法和结果的报告方式与临床意义；

3、了解荧光定量PCR的维护和日常检测项目。

二、见习步骤：

1、教师讲解临床基因扩增实验室设置的条件与要求；临床基因扩增实验室质量控制的方法和结果的报告方式；日常工作中的注意事项

2、教师按照日常工作程序，进行临床标本的检测，并进行讲解各种指标的临床意义；

3、教师讲解荧光定量PCR的维护；教师总结

三、注意事项

1、必须穿着白大褂，保持实验室安静，认真听老师讲解，并做好记录；

2、服从带教老师安排，不得随意触摸或翻动实验室仪器或资料；