HPLC法在中药药代动力学研究中的应用解析.docx

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HPLC法在中药药代动力学研究中的应用解析

・综述・

　　收稿日期:

2007-09-04　　作者单位:

11沈阳医学院奉天医院药剂科,沈阳110023;21辽宁中医药大学附属医院,沈阳110032。

HPLC法在中药药代动力学研究中的应用

李淑芳1,吴秀君2

　　[摘　要]　笔者从中草药有效成分的药代动力学研究及中药复方药代动力学研究两方面介绍了高效液相色谱法在中药药代动力学研究中的应用,并对HPLC/MS联用技术在中药药动学研究中的应用作了简单介绍。

[关键词]　HPLC;药代动力学;中草药活性成分;中药复方;HPLC/MS

　　高效液相色谱法（Highperformanceliquidchromato2

graphy,HPLC是在本世纪60年代末期,在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的新型分离分析技术,其采用高效固定相,以高压输送流动相,并配有各种检测器,使分离与测定组成一个统一系统。

由于HPLC法具有适用范围广、分离效能好、分析速度快、流动相可选择范围宽、灵敏度及特异性高、高度自动化等优点,自80年代用于中草药药代动力学研究以来,现已成为中药药代动力学研究的主要手段[1]。

1　HPLC法在中草药活性成分的药代动力学研究中的应用

中草药活性成分的药代动力学研究指的是从中草药中提取、分离、纯化其有效成分,结构鉴定后作为单体给药,研究其体内过程及药代动力学参数、药物浓度与药效之间的关系,这对于指导新药设计、临床用药、提高药物疗效和安全性具有重要意义[2]。

由于HPLC法适用范围广,几乎各类物质均可通过其得到有效分离,特别是反相色谱及反相离子对色谱的建立,使许多以前用一般层析不能分析分离的物质都能得到基本有效分离,目前其已成为中草药活性成分药代动力学研究中不可缺少的分析方法[1]。

李素华等

[3]

在研究灯盏乙素在家犬体内的药动学时,

用HPLC法测定6只家犬静脉注射灯盏乙素后不同时间血浆中灯盏乙素的浓度,血浆样品用甲醇进行去蛋白处理后进样分析,绘制药2时曲线,计算药动学参数。

结果灯盏乙素的药2时曲线符合三室模型,其T1/2pi、Tl/2α、

T1/2β分别为（1105±0180、（6199±2176、

（51161±28178min;Vc为（88011±50813mL;CL为（18916±5318mL/min;AUC0290、AUC02∞分别为（574143±133、（599134±132100

μg・min/mL。

提示灯盏乙素在家犬体内消除较快,临床给药方法或给药间隔时间的确定、制剂开发的剂型选择都应该考虑其T1/2。

李向阳

[4]

采用RP2HPLC法测定大鼠血浆中龙胆苦苷药物浓度,色谱柱为LichrospherC18（416mm×250mm,

5μm,流动相为甲醇2水（33∶67,V/V,血浆样品用高氯酸

沉淀蛋白后进样分析,结果在1~20mg/L范围内龙胆苦苷峰面积与浓度线性关系良好（r=019997,最低可定量浓度为0103mg/L,绝对回收率为8814%~9612%,准确度为9718%~10419%,日内、日间RSD均小于10%。

汪宝

琪等报道[5],血浆中龙胆苦苷的荧光测定法,虽灵敏度较高,但干扰因素多且操作繁琐,不宜用于药代动力学的研究,其建立的RP2HPLC法,灵敏、准确、简便,适合于龙胆苦苷的药代动力学研究。

以上介绍的两篇文章均采用直接去蛋白处理的方法处理血浆样品,该法可以去除体液样品中的大部分蛋白质,方法简便、快速。

蒋学华等[6]建立RP2HPLC法测定血浆中芍药苷浓度。

卢兴红等[7]以RP2HPLC法测定血浆中栀子苷的浓度时也采用此种方法。

然而,由于沉淀剂会给测定带来不利影响,为了提高方法的灵敏度,经常采用萃取的方式处理样品[8]。

孙言才等[9]用RP2HPLC测定小鼠血清中单皮酚的浓度时,血清样品用氯仿单步萃取,萃取物以氮气流吹干后,用甲醇溶解用于色

谱分析,血清样品浓度在0102~12180μg/mL范围内呈良好线性关系,回归方程为Y=271211836X-517137（r=

019999,该方法灵敏,重复性好。

周四元等[10]给Beagle犬

灌胃染料木黄酮后,以RP2HPLC法测定犬血浆、尿、粪便中原形药物的浓度,由于样品中药物浓度低,干扰物质多,无法直接测定,故用甲基叔丁醚2正戊烷提取后测定,方法灵敏、准确、可靠。

谢跃生等[11]建立了测定小鼠血浆中马钱素浓度的高效液相色谱法,并研究其在小鼠体内的药代动力学。

采用C18色谱柱,流动相:

甲醇2水（30∶70,流速为018mL/

min,检测波长240nm;血浆样品用固相萃取法预处理,结果

线性范围0101~500μg/mL,日内RSD<10%,日间RSD<

15%,回收率8610%~9115%,最低定量浓度为10ng/mL。

该方法灵敏度高,操作方便,适用于马钱素的药代动力学研究。

张慧等[12]建立了HPLC2FLU法测定血清中黄藤素含量的方法。

色谱柱:

LiCHrosorbSI60,流动相:

三氯甲烷2甲醇2二乙胺2冰醋酸（90∶9∶014∶015,荧光检测器Ex=365nm,EM=

510nm,血浆样品用三氯乙酸2氯仿提取。

结果黄藤素的最

低检测浓度为011ng/mL,在011~1010ng/mL有良好线性关系（r=019999,方法灵敏、专一、快速,可满足药代动力学研究的需要。

生物样品中的药物用RP2HPLC色谱分离时,要求其具有一定的亲脂性,对某些在体液中呈解离状态的有机药物,离子对反相HPLC是一种很好的方法。

如粉防已碱为有机生物碱,在体液中可能呈解离状态,而体液中内源性杂质多为极性大的物质,在血浆中粉防已碱与内源性杂质难以分离。

熊慧瑜等[13]在对小鼠血浆中粉防已碱浓度进行检测时,选用离子对反相HPLC法,用较大的非极性基团十

二烷基磺酸钠（SDS作为反离子,结果线性范围为50~2000ng/mL（r=019991,最低检测浓度为10ng/mL,日内、日间精密度RSD分别为3125%、9170%,方法精密、准确、重现性好。

2　HPLC法在中药复方药代动力学研究中的应用中药复方是中医治病的主要临床应用形式,研究中药复方的药动学规律,对于阐明中药的组方原理、作用机制及促进临床合理使用中药等都具有十分重要的意义。

然而,由于中药复方成分复杂、含量相对较低且干扰因素多,其药动学研究比上述的中草药活性组分的药动学研究具有更大的难度[14-15]。

HPLC法由于具有多种分离分析技术,目前在中药复方药代动力学的研究中占有重要地位。

211　HPLC法在中药复方有效成分的药代动力学研究中的应用　中药复方所含成分可能多达几十种甚至几百种,常根据具体情况选择其中一种或几种有效成分进行药代动力学研究[16]。

例如,马钱子生物碱是中药马钱子的主要成分,徐晓月等[17]用反相高效液相色谱法一次性测定马钱子砂烫炮制品中的生物碱士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物和马钱子碱氮氧化物在大鼠体内的药物浓度时,将血浆样品加氨水碱化后氯仿提取,色谱柱:

HypersilBDSCl8,流动相:

乙腈∶水（40∶60,每升含磷酸二氢钾34g及十二烷基硫酸钠17g,临用前配制;流速:

018mL/min;检测波长:

254nm;柱温:

25℃。

结果大鼠iv本品后检测,各成分得到很好分离,各主要成分的药代动力学在大鼠体内符合二室模型,该法为马钱子生物碱在人体内的药代动力学研究提供了参考。

黄芩苷是中成药银黄冲剂的代表成分,张志荣等[18]利用反相高效液相色谱,以紫外检测器为检索装置,用外标法考察银黄冲剂中黄芩苷在家兔体内药代动力学,为提高检测灵敏度,在分离柱前接一YWG2C18小柱作预处理柱,血浆样品甲醇超声震荡提取后进样分析,得回归方程为Y=1628087X-4503（r=019992,血样浓度在5~50ng范围内线性关系良好,黄芩苷在家兔体内的药2时过程符合一级吸收的二室开放模型。

该方法专属性强,灵敏度高,为银黄冲剂的合理应用提供了依据。

刘琦等[19]测定尿中丹参素及其在人体药动学时,采用SUPELCODSC218柱对尿样进行富集和净化后,再采用高效液相色谱法对尿中丹参素进行测定,共存组分不干扰,丹参素尿样浓度在012~50mg/L范围内线性关系良好,最低检测浓度为011mg/L。

柱切换高效液相色谱技术是近年来发展起来的一种高效液相色谱技术,它集净化、富集及分离为一体,样品前处理简单甚至不需要预处理即可直接进样色谱分析,适合分析含量低、干扰大、检测困难的复杂样品[20],该技术在中药复方药代动力学研究中显示了巨大的优越性。

赵新峰等[21]在研究复方丹参滴丸中丹参素人体药代动力学时,引入柱切换系统,血清样品用三氯乙酸提取,氮气流吹干,残渣用15%甲醇溶解后,采用大体积进样,对体内痕量代谢成分进行了富集、分离和测定,方法回收率为9910%,精密度及重现的RSD分别为2145%（n=5、1101%（n=5,线性范围010248~013720μg,方法精密度高,简单、灵敏。

梯度洗脱通过在洗脱过程中不断地有规律地改变流动相的组成比,从而使结构极相似的原药与代谢物得到分离[1],使用梯度洗脱可以大大提高中药复方体内药物分离分析的效果。

刘东锋等[22]建立的四逆散有效成分芍药苷在大鼠体内药动学的HPLC法,采用乙腈2水梯度洗脱系统洗脱血浆样品,提高了芍药苷与其他共存组分的分离效果。

212　HPLC法在中药复方配伍药代动力学中的应用　中药复方有“七情和合”配伍理论和“君臣佐使”的组方原则,同一味药往往处于不同的处方环境中,因此,同一种中药成分的药动学参数会受很多因素影响。

阴健等[23]以HPLC法进行了黄芩苷及其在清开灵注射液中的药代动力学研究,表明黄芩苷静脉给药后在兔体内符合三室开放模型,而给予清开灵注射液后,黄芩苷的血药浓度经计算机自动拟合符合二室模型,黄芩苷单用和在复方中使用所发生的房室模型的转变,其原因可能是清开灵注射液中栀子、胆酸等成分影响了黄芩苷的体内过程,但在两种情况下,统计数据无明显变化。

杨祖贻等[24]以HPLC法将赤芍及赤芍肉桂复方在小鼠血浆中芍药苷浓度进行了比较,在相同的实验条件下,赤芍组小鼠平均芍药苷血药浓度为（42128±4143μg/mL,而赤芍肉桂复方小鼠平均血药浓度为（54128±5181μg/mL。

提示在赤芍肉桂复方中,肉桂可提高赤芍有效成分芍药苷的血药浓度。

李永渝等[25]采用高效液相色谱法测定急性胰腺炎香猪用药后大黄素及汉防已甲素的血药浓度,结果显示,联合用药后,汉防已甲素的血药浓度明显提高,这可能是其协同效应的机制之一。

3　HPLC/MS联用技术在中药药代动力学研究中的应用HPLC/MS联用是将高效液相色谱仪与质谱仪用界面连接成一个完整的仪器,实现在线检测[26]。

HPLC/MS法具有高度的专属性,对多数药物的检测灵敏度超过其他分析方法,使定量测试速度显著加快,可以对混合物中的微量组分进行分析,已成为药物分析中的主流技术[27]。

杜王月等[28]建立大鼠血浆中汉黄芩素浓度的液相色谱2串联质谱法,血浆样品经液2液萃取后,进行色谱分离,采用三重四极杆串联质谱检测,结果线性范围为0125~20ng/mL,最低定量浓度为0125ng/mL准确度为-013%~113%,方法灵敏、快速、准确,可用于大鼠血浆中汉黄芩素浓度的测定及临床前药动学研究。

王素军等[29]在研究Beagle犬血浆氧化苦参碱的药代动力学时,用HPLC/MS法测定犬血浆氧化苦参碱的浓度,最低检测浓度可达到016μg/L,在2~5000μg/L的范围内呈良好的线性关系（r=019990,日内及日间误差均小于412%,方法灵敏、专属性强。

HPLC/MS联用法对于不同的药物分子,随着离子化程度的难易,其检测灵敏