高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法2.docx

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高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法2

高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法

药物分析2010-05-1413:

57:

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1色谱柱跑干了，处理方法：

将贮液瓶装入重蒸水，首先按purge键，将柱前气柱排出，若无法排出，可将色谱柱前拆下，用注射器抽吸。

待柱前气体排空后，连接色谱柱，用水高低流速交替冲洗色谱柱，直至柱压稳定为止。

2.基线不稳，有静电，处理方法：

检查接地是否良好。

3.峰面积变化非常大，处理方法：

检查是否进样阀堵塞。

4.基线突然提高，变粗，处理方法：

检查样品池能量，若低于正常值，说明检测器污染。

5.柱压变动范围较大，处理方法：

多为进气泡。

高低流速交替冲洗。

6.柱效或峰形突然变差，处理方法：

更换预柱。

7塔板数低：

色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响

8色谱柱易变性：

色说柱选择不对，二次保留的影响

9色谱柱寿命短：

色谱柱选择不对，样品需预处理（PH<3或PH>7）

10保留值变化：

色谱柱平衡不够，流动相比例改变

11出现新的干扰峰：

初始分离不够或初始样品无代表性

选择波长要从以下几个方面考虑：

1.检测波长要大于溶剂截止波长。

如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。

溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度下降。

2.对各组分都要有适当的吸收。

一般是不可能做到的。

所以只要选择一个对大多数组分都有较大吸收的波长就可以了。

3.外标法定量时，要选择被测组份最大吸收波长。

254nm对常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收。

对饱和基团也有弱的吸收。

而对于常见的乙腈、甲醇的透过率很高。

是在不知道用什么波长时最理想的试验波长。

（一）涡流扩散（Eddydiffusion）

流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。

如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。

因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。

（二）分子扩散（Moleculardiffusion）

分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。

要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。

同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。

（三）质量转移（Masstransfer）

被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。

在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。

当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡动相就向前移，这各物质的非平衡移动，使区带变宽。

四）动相流速

当流速太低时，分子扩散严重，特别是在气相色谱中尤为突出。

如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。

在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速咖大会降低柱效率。

五）固定相颗粒大小

定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。

1、开泵后压力即升高至最高限度，经过对色谱柱前，色谱柱，色谱柱后的分段测试，确定为检测池堵塞。

2、换检测波长后，色谱峰面积比以前做的小很多，怀疑进样环或管路漏夜，经检查，排除，最后确定为，检测波长的显示值和实际值不符。

由气味、景象和声音可以发现的问题

你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。

你最好养成习惯，每天花上几分钟运用你的感官（除了味觉）来“感觉”你的液相色谱是否存在问题，这样可以帮助你迅速找到问题所在。

例如：

在你看到漏液之前，你可能首先闻到它的气味。

大部分的问题是可以通过眼睛看到。

A、溶剂的气味

原因        解决方法

1、漏液1、见前

2、溅出2、a、检查废液瓶是否已满b、找到溅出的部位并清洗干净

B、热气味

原因                解决方法

1、仪器过热1、a、检查并调节通风设施b、检查并调节温度设定

c、关掉仪器，查找维修手册

C、读数不正常

原因                  解决方法

1、压力不正常1、见前

2、柱温箱问题2、a、检查并调节设定b、参照用户手册

3、检测器灯失效3、更换灯

D、灯警告

原因                  解决方法

1、压力超出极限值1、a、检查是否阻塞b、检查并调节极限值的设定

2、其它警示灯2、见用户手册

E、警告音

原因                  解决方法

1、溶剂泄漏/溅出1、找到并解决

2、其它警告音2、见用户手册

F、刺耳的短音或长音

原因                 解决方法

1、轴承失效        1、见用户手册

2、润滑不够        2、进行恰当的润滑

3、机械故障        3、见用户手册

进样阀可能发生的问题

A、手动进样阀，转动不灵

原因          解决方法

1、转子密封损坏  1、更换或调整转子密封

2、转子太紧     2、调整转子的松紧度

B、手动进样阀，载样困难

原因          解决方法

1、进样阀安装不当         1、重新安装

2、定量环阻塞             2、清洗或更换定量环

3、进样器污染             3、清洗或更换进样器

4、管路阻塞               4、清洗或更换管路

C、自动进样阀，不能转动

           原因                  解决方法

      1、无压力（或电源）  1、提供恰当的压力（电源）

      2、转子太紧          2、调整转子的松紧度

      3、进样阀安装不当    3、重新安装

D、自动进样阀，其它问题

    原因                    解决方法

          1、阻塞        1、清洗或更换阻塞部件

          2、机械故障    2、见随机维修手册

          3、控制器故障  3、维修或更换控制器

HPLC柱压过高：

1.拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；

2.把色谱柱从仪器上取下来，如果压力仍然不降，则是管路堵塞，须清洗，如果压力下降了，将柱子的进出口反过来接再仪器上，用10倍量柱体积的流动相冲洗柱子，如果柱压仍不降，再检查

3.更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明溶剂获样品中含有固体颗粒，若柱压还高，可在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器

基线不稳，上下波动或漂移

1。

流动相有溶解气体；用超声波脱气15-30分钟

2。

单向阀堵塞，取下超声去除堵塞物

3。

泵密封损坏，造成压力波动，更换泵密封

4。

系统存在漏液点，确定漏液位置并维修

5。

流通池内有赃物或者杂质，清洗杂物

6。

柱后产生气泡，流通池出液口加负压调节器

7。

检测器没有设定在最大吸收波长处

8。

柱平衡慢，特别是流动相发生变化时。

用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的心流动相对柱子进行冲洗

1.检测信号出现倒峰，检查检测器与主机相连接是否有松动，可以把下重新连接。

2.夏季气温高，水容易生菌，要求HPLC所用重蒸水必须每天都要更新。

3.由甲醇换到流动相平衡时，压力先稍稍下降，然后慢慢回升，可能是混合池混合效果不好，也可能是B泵轻度堵塞。

4.色谱柱长期不用，应用甲醇冲洗2h以上后，宁上两端螺丝保存。

岛津机器易出现的毛病是：

1、压力不稳：

单向阀堵塞，可拆下，用甲醇水超声；或漏液；管路过滤器损坏；

2、基线噪音变大：

未接地线，可在检测器的外壳外接一根铁丝连地；灯能量不足，可在funk功能中查找灯的使用时间，或拆开机器外壳，观看紫外灯的强度；检测池污染，拆下柱子，用无体积连接器连接泵和检测器，用异丙醇小流速冲洗半个小时即可；流动相污染或进气泡。

3、泵头有盐析出：

应经常用5％异丙醇清洗柱塞杆，否则易磨损。

4、进样口漏液：

可能是标准针头变形或损坏，使得进样器磨损，不好的针头应及时扔掉。

位同仁，为保证我们的分析效果，延长色谱柱的使用寿命，大家一起来贡献一下自己在色谱柱使用过程中的护柱秘诀吧。

我先来聊聊，算是抛砖引玉了

1、最好用预柱。

（但要注意，若有时出峰异常，要先看看是不是它有问题了）

2、每次做完分析，都要进行冲洗，

分析用流动相中若无酸、碱、盐类物质，建议用90％甲醇冲洗30～60min；

若分析用流动相中含以上物质，要先用10％甲醇（或用与分析用流动相同比例，把含酸、碱、盐溶液换成水）冲洗1小时左右，再梯度走到90％甲醇冲洗30～60min（若用多元泵）。

有必要时再循环几次，可以适当缩短时间。

若长时间不用该色谱柱，要冲洗好后，用纯甲醇或乙腈封存。

3、若流动相中用到离子对试剂，更应该好好冲洗，且该色谱柱最好作为专用，不能再做其它物质分析用。

因色谱柱填料性质已与原来所不同，在该柱上所摸索的色谱条件，可能在其它同类柱子上得不到重现。

4、尽量避免反冲，除非该色谱柱厂家明确说明允许。

5、普通C18柱尽量避免在40℃以上的温度下分析。

6、定期测柱效，有下降，可以用10％异丙醇甲醇冲洗色谱柱。

若柱效还没有改善，可以再生，甲醇－二氯甲烷－甲醇。

呵呵，还有的一时想不起来了，各位有经验的战友请发表高见！

1．样品要采用0.22或0.45μm滤膜过滤，流动相采用0.45μm滤膜过滤并脱气。

2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围

3．避免流动相组成及极性的剧烈变化。

4.避免纯水冲洗反相色谱柱。

5．每次测试完毕，要用20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱（分析色谱柱250×4.6mm柱体积3.2ml）。

如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕后将柱子用纯水冲洗干净，并保存于乙腈中。

6．压力升高是需要更换预柱的信号。

helen_guwrote:

1．样品要采用0.22或0.45μm滤膜过滤，流动相采用0.45μm滤膜过滤并脱气。

2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围

3．避免流动相组成及极性的剧烈变化。

4.避免纯水冲洗反相色谱柱。

5．每次测试完毕，要用20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱（分析色谱柱250×4.6mm柱体积3.2ml）。

如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕后将柱子用纯水冲洗干净，并保存于乙腈中。

6．压力升高是需要更换预柱的信号。

避免流动相组成及极性的剧烈变化。

是不是流动相组成改变时要有个梯度,缓慢升或缓慢降?

那要多慢呢,比如说我用水和乙腈做流动相,想从20:

80升至100:

0,设定多长时间比较合适呢

另外,纯水冲反相柱的缺点是什么呀?

请多指教,谢谢了

说说防止色谱柱堵塞的问题吧：

1：

溶剂中的不溶物—应使用色谱纯溶剂，膜过滤（孔径不超过0.45μm）

2：

样品中的不溶物—应对样品进行膜过滤（孔径不超过0.45μm）

3：

泵，进样器等中的不溶物—在泵和进样器之间安装内置过滤器，在进样器和柱之间安装预过滤器

4：

柱内不溶物的形成：

由于溶剂的不互溶而产生的沉淀—用能溶解沉淀物的溶剂冲洗色谱柱；在不互溶溶剂中由于进样而产生的沉淀—检查样品液和流动相是否互溶；由于温度的改变或固定相的干涸而产生的沉淀—将色谱柱密封紧，并保持室温