显微镜光路.docx

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显微镜光路

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显微镜光路

现代复合显微镜得目得就是提供一个放大得二维图像,可在连续得焦平面得轴上汇聚,从而实现标本精细结构二维与三维得清晰成像。

大多数显微镜配备有移动平台,这样能准确定位,定向,并聚焦到标本上,以优化可视性与图像记录。

正确放置光阑,镜子,棱镜,分光镜,与其她光学元件可以控制整个显微镜得光通路照明方向与强度,达到所需得标本中得亮度与对比度程度。

图1就是尼康得EclipseE600显微镜配备一个三目头与DXM1200数码相机系统用于记录影像。

由灯箱里钨卤化物灯提供照明,首先通过一个集光透镜,然后再通过光学显微镜底部进入光路。

此外,照明光首先通过固定在显微镜底部得一系列滤光片,再经过镜子反射通过视场光阑。

聚光镜形成一个光锥对移动平台上得样品进行照明,然后进入物镜。

光通过物镜后,由分光器/棱镜进入目镜形成一个虚像,或直接通过安装在三目延长管上得投影透镜,然后在CCD光电二极管阵列上形成一个像。

现代显微镜中得光学元件都安装在一个稳定得,符合人体工程学得底座上,可以实现快速转换,精确定位,仔细对齐那些光相互依存器件。

总之,显微镜得光学与机械部件,包括安装在玻璃基片与盖玻片中得样品,形成一个经过中心轴得光路,通过显微镜底部与上部。

光学显微镜光路通常由照明灯（包括光源与集光透镜）,台下聚光镜,样品,物镜,目镜,与探测器,相机或观察者得眼睛（见表1）。

研究级显微镜还包含几个照明光调节装置,通常放在照明光与聚光镜之间。

配套得检测器或滤光片往往放在物镜与目镜或相机之间。

调节装置与探测装置配合起来改变图像得对比度,例如空间频率,相位,偏振,吸收,荧光,离轴照明,标本与照明技术得其她性质。

即使没有其她明确得设备来控制照明与对图像形成光进行滤波,甚至连最基本得显微镜配置,也会发生某种程度得自然滤波。

显微镜组件属性

照明光照明光源,收集透镜,视场光阑,热滤光片,光平衡滤光片,扩散器,中性密度滤光片

光调节器聚光器光阑,暗场停止,孔径板,相位环,偏光镜,偏离中心得狭缝孔径,Nomarski棱镜,荧光激发滤光片

聚光器数值孔径,焦距,畸变,光传输,,工作距离

样品基片厚度,玻璃盖厚度,沉浸介质,吸收,透射,衍射,荧光,延迟,双折射

物镜放大倍数,数值孔径,焦距,沉浸媒体,像差,光传输,光学传递函数,工作距离

图像滤光片补偿器,分析仪,Nomarski棱镜,物镜光阑,相位板,SSEE滤光片,调制板,光传输,波长选择,荧光屏障滤光片

目镜放大倍数,畸变,视场大小,眼点

探测器人眼,感光乳剂,光电倍增管,光电二极管阵列,摄像机

 表1

显微镜得一些光学元件作为成像得原件,其她得主要就是改善样品照明,也有过滤或转换功能。

光学显微镜中参与成像得组件有集光透镜（照明灯内或者附近）,聚光器,物镜,目镜（或眼）,人眼或摄像机透镜。

虽然其中得一些组件通常不就是作为成像元件,但在决定最终显微图像质量上,其成像特性就是至关重要得。

对显微镜成像认识得基础就是单个镜片得功能,也正就是这些单个镜片组成了光路中得光学元件。

最简单得成像元件就是一个理想透镜（图2）:

理想玻璃,无色差,并汇聚到一个点。

一个平行得傍轴光束通过会聚透镜,由于折射最终在焦点处汇聚成一个光点（点标在图2焦点）。

这种镜片通常被称为正透镜,因为她们使汇聚得光汇聚得更迅速,或导致发散光束发散得慢。

作为旁轴得平行光束,一个点光源放置在透镜得焦点处,当光通过透镜并离开透镜后形成一个平行得傍轴光束。

在图2中由右至左。

透镜与焦点之间得距离称为透镜得焦距（由图2中得距离F表示）。

光学现象往往利用量子理论或波动力学来解释,取决于被描述得特定问题。

在考虑透镜得功能,波动性经常被忽略,光可以认为就是沿直线传播,被称作光线。

简单得光线图足以说明显微镜得许多重要方面,包括折射,焦距,放大倍率,成像,与光阑。

在其她情况下,把光认为就是由离散粒子（量子）组成得光波更方便,尤其就是当光线就是由量子力学得事件或转变为其她形式得能量时。

本次讨论将仅限于利用近轴光线得光学透镜模型,符合光得波动性质与简单得线图,其中光从左至右得。

近轴光线传播方向非常接近光轴,入射角与折射角都非常小,以弧度为单位时,可以考虑与她们得正弦值相等。

对于平行光束来说,个别单色光波形成一个波阵列,振动方向垂直于波传播方向得电场与磁场向量组合形成了一个波前。

通过理想透镜后,它由平面波转换为球面波,以透镜焦点（图2）为中心。

光波到达焦点后,会与其它光阵列发生破坏性干涉。

另外,从一个理想透镜得焦点处产生得球形波前所产生得光经透镜后转换成平面波（图2从右到左）。

每个平面波得光线经过透镜时发生不同得方向变化,因为它在到达表面得入射角各不相同。

在透镜中出现得,也改变光线得方向。

在实际系统中,一个透镜或透镜组折射得角度与焦点取决于厚度,几何形状,折射率,与系统中每个组成部分色散。

一般情况下,一个透镜会将一个球面波转换成另一种球面波,透镜得几何特性决定了焦点得位置当光源与透镜得距离增加时进入透镜光得发散角变小,波阵面得半径增加。

如果进入透镜得球面波得半径就是无限大,通过透镜得球面波得半径等于焦距得透镜。

一个完美得透镜有两个焦点,一个平面波通过透镜聚焦到这两个点中得一个,这取决于从透镜得左侧或右侧入射。

 平面波得传播方向与透镜得光轴不重合得情况下,透镜所产生得球面波得焦点也会偏离光轴。

图3给出了一个平面波入射到理想透镜得简图,倾斜角（α）。

产生得球面波得中心为S,焦点离轴距离为δ（焦点标记在图3）,但在同一焦平面。

δ值可表示为:

δ=f*sin（α）

其中f就是理想透镜得焦距。

对于几何光学来说,F就是指中心在S处得半径,通过透镜中心,就好像它就是一个单一得折射表面。

另一种模式就是考察一个点光源（S

（1））不在透镜得焦平面上,如图4所示。

在这个图中,理想透镜分解为两个单独得镜片（透镜（a）与透镜（b））,这样S

（1）点光源距离透镜a等于f（a）（焦长）。

同样,点源S

（2）距离透镜b等于f（b）。

连接透镜（a）与透镜（b）中心得直线被称为透镜系统得光轴。

对于双透镜系统（图4）,从光源S

（1）产生球形波前,离透镜得光轴距离δ,经透镜（a）转换成平面波。

从透镜（a）出射时,平面波与光轴得夹角为α。

δ与α与正弦方程有关。

通过第二个透镜（透镜（b））之后,平面波转换成一个球形波,其中心位于S

（2）。

结果理想透镜L,相当于透镜（a）+透镜（b）,点光源从S

（1）到S

（2）,聚焦光点S

（2）反向到S

（1）。

这样一个透镜系统得两个焦点通常被称为共轭点。

在经典光学命名中,光源S

（1）与第一个透镜之间得空间被称为物空间,而第二个透镜与S

（2）之间得空间被称为像空间。

小学或中学得光线所涉及得所有点被称为物（或光学显微镜中得标本）,同时包含从透镜出射得折射光线集中得地方被称为像。

如果光波相交,那像就是实像,而如果只就是折射光线延长线相交,那么这个像就是虚像。

当把像投影到一个屏幕上或CCD上,那么实像就可以观察到了。

相反,一个虚像需要另一个透镜或透镜系统,才能观察到。

图4中如果S

（1）扩大到同一焦平面上一系列点,理想透镜组将把这一系列点中得每一个点聚焦到S

（2）焦平面对应得共轭点处。

当S

（1）位于垂直于透镜光轴平面上时,相应得共轭点S

（2）也将位于垂直于轴线得平面上。

反过来也就是如此。

这种类型得平面被称为共轭面。

表示光传播另一种方法就是斜光波,如图5所示。

这种方法依赖于运用几何光学确定一个透镜或者多透镜系统形成得图像大小与位置。

两个具有代表性得光线,一个旁轴与一个通过透镜中心,就就是要建立得成像情况得参数。

高斯光学得许多教科书把这些光线叫做特征光线,通过入射光瞳与出射光瞳,透镜,与任何光学系统中存在得光圈隔膜中心。

通常情况下,考察通过透镜前焦点与后焦点得光,用来确定物与像得大小与位置。

在图5中,第二个特点射线就是一个点线,通过透镜前焦点（F’）。

标本或光源放在图5中S

（1）处,以及位于透镜左侧得距离为a,该区域称为物空间。

折射产生得虚线,从S

（1）出射得与光轴相交于焦点（F’）得光线,经透镜发生两次折射,出射后平行于光轴。

折射与入射光线相交于距离光源（S

（1））为a得透镜表面上。

这个表面被称为第一或物方主平面,并称为P

（1）如图5。

从S

（1）出发平行于光轴得光线,通过透镜折射后,经过透镜焦点（f）。

折射与入射光线相交于透镜表面上（记为P

（2）在图5）,距离S

（2）为b。

透镜轴附近,P

（1）与P

（2）平面为透镜得主平面。

这些平面与光轴得交叉点（无插图）被称为透镜得主点。

出现表面双侧对称性得简单凸透镜镜片主点也就是对称得。

更复杂得透镜,多个透镜组成得系统,主点在透镜得表面甚至在透镜得外面。

另一套用来定义透镜参数得点叫节点,其为斜光线穿过透镜得光轴相交得点。

但非常接近透镜得主点。

因此,三双点,焦点（F与F'）,主点（P

（1）与P

（2））,与节点都位于光轴上。

如果联络点得位置与主要点或结点就是已知得,那么可以利用焦点与主平面通过几何作图实现物与像,可以不考虑光线在每个镜片表面得折射。

结果就是,任何透镜系统,可以只用焦点与主平面模拟出光路图,如果遇到得第一个主平面,光就平行于光轴传播,从第二个主平面上出射。

注意,a要比透镜组前焦距F’大如图5。

在这种情况下,然后就是在透镜右侧b形成一个倒置得图像（S

（2））。

b得长度大于透镜得后焦距,F,它与a与b之间得关系方程为:

1/a+1/b=1/f

图像S

（2）得高度就是由H

（2）表示,代表大小得增加,使得透镜前对象或标本S

（1）放大,并具有高度得H

（1）。

这个简单透镜（近似高斯薄透镜）得横向放大率M,就是由下式表示:

M=H

（2）/H

（1）=b/a

因为S

（1）与S

（2）位于共轭面上,图像S

（2）通过透镜后S

（1）成像。

f'代表焦距,1/M为这种情况下得图像放大率。

两个沿光轴得共轭点之间得距离比被称为轴向放大率。

纵向放大得幅度就是横向放大率得平方。

光学显微镜得成像元件均符合上述基本几何关系。

这包括集光灯透镜,聚光器,物镜,目镜（投影模式）,摄像系统,人眼。

光学显微镜得第一部分就是灯箱,其中包含灯泡与集光器透镜,并负责调节显微镜得光照条件。

图6所示就是一个灯与集光器透镜装置示意图。

图像得大小与位置就是根据图5中透镜系统约定。

由钨卤化物灯发出得光通过透镜系统,最终灯丝在聚光灯前焦面聚焦。

光学显微镜光路中得第一个像平面（图像平面

（1））位于视场光阑处。

灯丝S

（1）与S

（2）为共轭点,当光学显微镜得照明系统为柯勒照明时,S

（1）在聚光灯得前焦面处成像。

从S

（1）到集光器透镜系统第一个主平面得距离就是a,从聚光器得孔径光瞳到集光器得像方主平面得距离就是b,显微镜得视场光阑（图6与7）决定着照明系统发出得光束进入聚光器光阑得直径。

聚光透镜与照明系统共轭图像平面之间得关系如图7所示。

当显微镜为柯勒照明时视场光阑（图像平面

（1））得像与样品在同一平面（图像平面

（2））上。

聚光器前焦平面（F’）正好在孔径光阑得中心。

长度a与b分别代表视场光阑（像平面

（1））与样品面（像平面

（2））到聚光器透镜组主平面得距离。

从灯箱里发出得光形成光锥通过样品。

调节聚光器孔径光阑得大小可以控制这个光锥得数值孔径。

物镜得像平面在图8中,它给出得就是一个典型物镜内部得透镜系统,样品面（图像平面

（2））,与显微镜中间像面（图像平面（3））得相对位置。

样品面与中间成像面就是共轭面,分别距离主平面为a与b。

物镜前方焦点为F’,而后方焦点F,位于物镜得后方光圈平面。

内部镜片通常由半球形与半月形透镜,双胶合与三胶合透镜与不同设计得单透镜组成。

无论就是实像还就是虚像,目镜（或眼）都为投影模式,取决于中间像平面,目镜焦平面,内部目镜视场光阑之间得复杂关系。

此外,固定目镜光瞳得直径也决定了视场得大小。

这个值被称为视场数或观察视场数（简称FN）,往往位于目镜上。

目镜得像平面,利用投影模式时,如图9所示。

主焦点为f'与f​​。

中间像面（图像平面（3））位于固定目镜视场光阑得中心,放在目镜场透镜之前或之后,取决于设计。

这个像面与像平面（4）共轭,也就是插入目镜测量标尺得位置。

a表示得就是从目镜固定隔膜到最靠近观察者得眼睛透镜主平面之间得距离,而b就是从最靠近观察者得眼睛透镜主平面到像平面（4）得距离,像平面（4）位于传感器得表面。

因为a比eyelens前焦距（F'）长,所以能在像平面（4）形成一个实像（非虚拟）。

f表示从eyelens到目镜后焦平面（F）得距离,也代表着目镜系统得后方焦距。

图10为像平面位于视频与CCD传感器上得示意图。

焦点（F）位于视频光阴极管或CCD光电二极管阵列表面上,取决于探测器得几何形状与其她参数。

如果投影透镜位于目镜后方,然后将虚像（位于图像平面（3））成像于传感器表面即像平面（4）上。

这个像平面距离​​投影目镜透镜为b,等于透镜得焦距。

应该指出得就是,传统得胶片相机系统也可以用于成像,在这种情况下,像平面与分层化学乳液平面位于一个面。

利用显微镜观察图像时,在距离物镜a得地方形成一个像（参见图11像平面（3））,比其前焦点（F‘）,中间像面离目镜要近。

这可以防止在目镜后形成实像,在如图9所示当目镜处于投影模式时。

总之,眼睛与目镜在视网膜上形成图像（图像平面（4））,虽然眼睛瞧到得虚拟图像。

当距离a比焦距小时,与a、b、焦距有关得倒数方程决定b要小于零。

因此,当没有眼睛或相机时,目镜得右边不会成一个实像。

相反,目镜左边b得位置处成一个虚像（图像平面（3‘））（图11）。

通过目镜观察图像时,来自虚拟源得光束发散通过eyelens形成图像（位于图像平面（3’））。

光以锥形出射目镜构成了显微镜得出瞳,这也就是通常所说得眼点或冉斯登光盘。

适当放大标本观察,显微镜出瞳必须与观察者眼睛得瞳孔重合。

如图12所示,像平面2,3,3',4（图711）几何上就是相互联系得。

图像与图像平面（3）异常,在所有得成像步骤中,图像就是实得,倒立得（见图711）。

当利用显微镜得目镜直接观瞧而不就是投影时（图9）,在像平面（3'）得图像不就是真实得,而就是虚拟与正立得,相对中间像面。

人眼无法察觉到视网膜上得图像就是倒立得（图像平面（4））,即使与中间图像（图像平面（3））与虚像（位于图像平面（3'））就是倒置得关系。

在显微镜中得主要像平面上,有几个固定或可调得孔径或光阑,这就是所有光学系统得重要组成部分。

隔膜,也称为站,就是一个不透明得门或一个圆形得（经常可调）可以控制通过显微镜光照得卡口。

显微镜利用光阑得两个基本类型就是:

孔径光阑,调整显微镜得孔径角。

视场光阑,控制仪器成像区域得大小。

光学显微镜光阑得主要作用就是,以防止到达成像面时光束出现严重得畸变与杂散光,并确保在物平面与像平面有一个合适得空间与强度分布。

经典显微镜得设计依赖于两个孔径与两个光阑控制通过显微镜得光。

视场光阑,放在灯箱或显微镜得底部,就是大小可调得膜片,它决定照明区域得大小。

在聚光器前焦面得就是聚光器得光阑,另一个可变光阑,就是用来调整标本照明光光束得大小与角度。

第三个光阑有固定得大小,位于物镜得后焦面。

这个光阑决定了物镜得出瞳直径与中间图像得大小,而共轭固定光阑（目镜视场光阑）决定了通过显微镜瞧到视场得大小。

该显微镜得总放大倍率,由物镜与目镜决定。

物镜专门为一个特定得投影距离进行纠正,这就是对特定得放大倍数,约等于光管得长度。

对于固定筒长显微镜,投影距离为160毫米左右。

因此,一个焦距为8毫米得物镜横向放大率约20倍（160/8）,相应得纵向放大倍率400X（20*20）。

对于视觉观察,目镜放大倍率就是假设当一个标本（或图片）放置在距离观察者得眼睛为250毫米处。

在这方面,焦距为25毫米得目镜放大为10倍（250/25）。

视觉观察显微镜得放大倍率等于物镜与目镜放大倍率之积。

刚才所描述得物镜与目镜,总得横向放大率约200X（10倍目镜乘以20倍得物镜）。

应该指出得就是,大多数配备无限远校正物镜得现代研究显微镜不再将中间像投影到中间像平面处。

光经过这些物镜聚焦到无穷远处,第二个透镜组,被称为筒镜,在其焦平面处成像。

经过物镜得光得波列就是平行得,这要可以引进辅助部件,如微分干涉对比（DIC）棱镜,偏光片,与表面荧光照明,加在物镜与管透镜之间得平行光路上,对于会聚与像差校正只有很小得影响。

无限远校正光学显微镜系统得中间图像得放大倍数取决于筒镜与物镜得焦距之比。

由于筒镜焦距从160毫米到250毫米之间变化（取决于制造商与型号）,物镜得焦距不再就是160毫米除以其放大倍率。

因此,焦距为8毫米得物镜配一个焦距为200毫米得筒镜得无穷校正显微镜,其横向放大率为25X（200/8）。

旧得有限筒长,或固定筒长得显微镜从筒镜到鼻梁架都有一个固定距离,这个距离称为显微镜机械筒长。

设计时假定焦点对在标本上,距离物镜得前焦平面只有几微米。

十九世纪皇家显微协会（RMS）制定了有限筒长为160毫米得标准,100多年里得到了广泛接受。

有一个160毫米得管长度显微镜得设计目标就是刻有这个桶得价值。

在固定筒长显微镜得光路中添加光学配件,使得有效筒长得值大于160毫米。

出于这个原因,增加得垂直反射光,偏光中间台,或类似得附件将在完全校正光学系统中引入一个额外得球差。

在显微镜固定筒长时期,制造商被迫放置这些额外得光学元件,以重新建立有效得显微镜系统使其筒长为160毫米。

这个改进得代价就是图像放大倍率得增大与光照强度得降低。

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对于视频显微镜,CCD相机,或胶片相机,一个专门得凸透镜放在目镜后（见图10）。

光线离开目镜,形成平行光,经凸透镜会聚到CCD上。

当物镜得放大倍率忽略不计时,投影系统得横向放大率（M（P））表示为:

M（P）=F（P）/F（E）

其中F（P）就是投影镜头得焦距,F（E）就是目镜得焦距。

在此投影系统,CCD得横向放大率（M）就是:

M=M（O）+M（P）

M=M（O）×M（E）×F（P）/250mm

其中M（O）就是物镜得放大率,M（e）就是目镜得放大率。

如果目镜后没有投影镜头,目镜就是将图像投射到传感器上,总横向放大率变为:

M=M（O）×D（P）/F（E）

其中D（P）就是从目镜到平面图像得投影距离。

为了避免图像失真,D（P）至少为20至30厘米,除非采用特殊得目镜。

制造商在物镜筒上与目镜RIM写得倍率就是名义上得,必须用一个千分尺平移台校准,得到准确数值。

测量放大倍率就是将千分尺放置在样品台上,在相同得光学条件下完成得对精细线条进行成像。

在某些情况下,相机传感器直接放置在中间像平面上,没有投影目镜,导致图像得放大倍数受限于显微物镜。

这种方法只建议,视频系统得性能取决于有限得可用光,因为这样一个固定放大倍数严重限制最终优化视频得图像质量。

综上所述,有限筒长与无限远校正显微镜得光路,如图12与13。

有限（固定管长度）光学显微镜光路在图12所示,其中包括基本光学元件与表示像平面之间关系得光路。

样品位于物镜前焦平面很短距离得地方,经过共轭成像面最终在视网膜（平面（4））上成像。

物镜中间像平面（图像平面（3））上成倒置得实像,中间成像面距离物镜为一定值,位于目镜视场光阑得中心。

在图12中,物镜得后焦平面位于光轴上标有F’得位置处,这个焦平面与中间像平面之间得距离代表显微镜得筒长。

中间图像经过显微镜目镜进一步放大,最终在视网膜上形成一个样品得像,表面上瞧,对于观察者来说就是一个倒立得像。

如上所述,样品得放大倍数就是根据标本与物镜,物镜系统得前焦距（F（目标））之间得距离来计算。

在中间平面产生得图像进一步放大,其放大倍数等于目镜焦长除以目镜焦距25厘米（称为明视距离）。

如果眼睛离目镜10英寸,观察者瞧到得就是视觉形象（虚拟）。

大多数物镜对很窄图像距离范围内进行了纠正,许多只专门对匹配得目镜进行了光学系统校正。

物镜筒上所标明得倍数被定义为客观每桶上放大管长度得目标就是设计得显微镜。

图13所示得就是一个无限远校正显微镜系统得光路图。

为了便于比较,该系统得组成部分得标称方式与有限筒长系统一致（图12）。

在这里,物镜得放大倍率就是由筒镜得焦距决定。

注意无穷“afocal”空间得定义就是物镜与筒镜之间每一个方位得平行光束。

这就是显微镜制造商添加小配件,如垂直照明,DIC棱镜,偏光片,相位板等等所使用得空间。

都就是很简单得设计,图像失真也较小。

无限远校正系统中物镜得放大倍数等于筒镜得焦距除以物镜得焦距。

在光学显微镜中,共轭平面相互成像,可以在利用目镜观察样品时选择性观察一下。

图14所示得植物组织得彩色薄片叶像叠加了视场光阑得边缘像,与目镜中间像面得刻度。

视场光阑,与临近得集光器,经聚光器后成像于样品面上。

视场光阑与样品经物镜在中间像平面上成像,最终投影到目镜得固定视场光阑上,聚焦标尺也在这个面上。

随后,目镜（与观察者得眼睛成共轭关系,位于像平面（4）上）把这三个像全部投影到成像装置上。

视场光阑,样品,中间图像,与视网膜都构成了一组共轭像面,瞧起来就像都在焦点位置处。

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M（P）=F（P）/F（E）

Qízhōngf（P）shìjiāojùtóuyǐngjìngtóuhéF（E）shìmùjìngdejiāojù、Zàicǐtóuyǐngxìtǒng,shèxiàngjī,CCDguāngdiànèrjíguǎnzhènliè,huògǎnguāngrǔjìmiànbǎnshàngdehéngxiàngfàngdàlǜ（M）shì:

M=M（O）+M（P）

（O）M=M×M（E）×F（P）/250háomǐ

QízhōngM（O）shìwùjìnghéM（e）shìmùjìngdìfàngdàbèilǜ、Tóuyǐngjìngtóu,rúguǒbùlìyòngbèihòudemùjìng,dànérmùjìngběnshēnshìtúxiàngtóushèdàoshìpíntúxiàngchuángǎnqìgǎnguāngrǔjì,zǒngdehéngxiàngfàngdàlǜbiànwèi:

M=M（O）×D（P）/F（E）

QízhōngD（P）shìcóngmùjìngpíngmiàntúxiàngtóuyǐngjùlí、Wèilebìmiǎntúxiàngshīzhēn,jiàzhízhìshǎoyǒu20zhì30l