革新性的QuEChERS方法.docx
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革新性的QuEChERS方法
QuEChERS技术面世才几年，然而已在多农残分析、多类农药分析等领域带来了革新。
专栏作者RonMajors采访了QuEChERS的发明者MichelangeloAnastassiades与SteveLehotay，就其在日新月异的样品处理技术中取得的成就、挑战、以后的发展方向作出了探讨。
如何对越来越复杂的样品基质进行痕量分析及其样品前处理已成为业界一个大的挑战。
现在，为了满足全球日益增长的人口需要，食物产量得到很大的提升，这也导致了多种有毒农药的使用。
农药的施放有时会显得“宁可错过，不可放过”，即使可能农产品本身不需要，也会被施放，所以对于这些农药的痕量检测，检测工作者必须不断改善其检测技术。
因此，关于多类农药的农残分析方法就得到了重视，特别在我们的食物供应频频出现污染事件的这段时间。
传统的样品处理技术经历了液固萃取、液液萃取、固相萃取几个阶段。
在2003年，根据这些萃取的经验，美国农业部的化学家发明了一个在各种水果、蔬菜中有效分离痕量农残的方法。
配合液质、气质的高灵敏性、选择性，QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、ruggedandsafe，见右图）技术得到了长足的发展。
水溶液中的固体样品加盐后经过乙腈萃取，接着通过液固萃取（也就是分散基质萃取）去除乙腈中存在的大部分干扰物，萃取液就能直接进行质谱分析。
现在QuEChERS已经成为了全球检测水果、蔬菜中农残时的标准样品处理方法。
除此以外，其应用也涉及到越来越多的不同领域，比如肉类、血液样品、酒、甚至土壤中抗生素、药物、滥用药、还有其他污染物的检测。
下面是采访的内容：
主要的改良
Q：
QuEChERS最早在2003年面世。
从开发到现在，你们觉得该方法中三个最大的改良分别是什么呢？
A：
在QuEChERS的构思阶段，我们对大范围的代表性农药、样品进行了多次的实验去评估每次提取、净化步骤。
最初的2003年的QuEChERS版本对于被测物及其基质来说是不错的，甚至优于当前的版本。
当我们在对不同样品中上百种农药进行方法验证时，我们发现大概有10种农药的回收很容易受PH的影响，而过程中使用PH＝5的缓冲液是不错的解决方法，因此在之后的方法中我们也注意缓冲液的使用。
这是方法的第一个改良（不足的地方是缓冲液的使用也会导致一些杂质的增多，因此我们宁愿叫这个做方法的调整）
其次，C18填料与PSA的一起添加能明显地改善某些样品的净化效果，特别是那些富含油脂的样品，比如橄榄油，而其这并不会造成被测物的损失。
Lehotay对没能统一C18在AOAC2007.01与EN15662的使用感到十分遗憾：
AOAC官方方法2007.01中没有提及可以添加C18，相反欧盟标准方法EN15662却可以。
有化学家采取冷冻的方法去降低脂类的干扰，这同时也能除去一些在之前萃取中带入的杂质，但是相比之下，C18无疑是更快、更容易的，而且去脂效果与冷冻法相当。
最后，叶绿素、类胡萝卜素这类杂质的去除可以加入如CEN标准方法156627所述的少量石墨化碳黑或者加入美国UCT公司的ChloroFiltr®吸附剂，这会对某些平面结构的农药造成25％左右的损失。
另外需要再补充的就是，有时遇到含有较多油脂的谷物时，可以提高PSA的用量。
主要的困难
Q：
在QuEChERS方法的开发时遇到过的三个最大的困难（setbacks）是什么呢
A：
我们并不认为在开发这个方法时遇到过什么大的挫折。
现在销售QuEChERS产品的供应商正持续增多（见右图）。
QuEChERS自从在第四届欧洲农残专题讨论会公布后反响巨大并从此得到很大的发展。
比如，Anastassiades把QuEChERS方法与欧洲沿用了15～20年的方法进行比较得出前者能节省95％的溶剂（10mlVs535ml），95％的耗材成本，还有90％的时间。
只要你查看欧洲参加的每年对水果、蔬菜进行的农药检测报告，你就会发现在2009年130～150个参加的实验室中有接近有40％是使用QuEChERS方法的。
对于私人实验室，由于他们更加考虑成本，QuEChERS的采用率会高至接近70％。
QuEChERS方法使用中的最大困难恰恰来自于其优势：
灵活性强。
对于上百种样品、上百种农药而言，方法进行或多或少的变化都能得到较高的回收率。
有人曾经说过“分析方法就像是牙刷，每个人都情愿只用自己的一个”我们已看到在原来方法的基础上已出现了多种调整，也包括在文献中提及的两个针对性较强的QuEChERS官方方法。
检测中方法的调整是必须的，但是现在许多时候，它给人的印象往往好像只是仅仅为了标新立异地写一篇文章，一篇报告，而这些调整往往使得方法变得更加耗时、更易受影响、更花钱。
我们是这样克服这种方法改良上分歧的：
当时Anastassiades想用柠檬酸缓冲液（相对低的缓冲容量），Lehotay却想用醋酸缓冲液（较高浓度，拥有更大的缓冲容量）。
我们都有各自的理由，最后两个方法也都被许多实验室在不同的食物上进行了充分的验证。
其他一个来自方法灵活性的困难是其能适应不同的样品大小、不同的进样体积、不同的溶剂。
因此，供应商根据全球不同实验室的要求设计了一大堆不同的产品。
过多的规格可供选择导致分析时容易产生混乱。
或许所有多种类农残分析方法中最大的困难就是对于某种农药（比如克菌丹，敌菌丹，灭菌丹和百菌清）不能得到高的、持续稳定的回收。
酸性环境能减少这类农残的损失，但是这些被测物却容易在非酸性的样品中发生降解，这情况发生时有时样品还没被进行萃取。
不幸的是，这类化学物并不适用于液质分析，而其气相分析也存在问题。
在气质分析时，必须严格控制好相关条件才能得到高质量的检测结果，而这在日常检测中是不大可能的。
因此，QuEChERS被一些人批评还不够完美。
在一些原创的QuEChERS论文中，通过使用被测物保护剂（analyteprotectants简称APs），可以减少这类麻烦出现。
方法的统一
Q：
你们之前都是用最先的方法进行检测的，然而当你们发展了自己各自一套后，你们的这些改良却又导致了另外两个不同的提取步骤。
因此现在，就变成有三个标准方法了：
最早的、AOAC官方方法2007.01（Lehotay与其同事参与开发的）、CEN标准方法EN15662（Anastassiades与其同事参与开发的），除此以外还有许多差不多的改良方法。
有没有打算统一一下，使得用户能有一个通用的方法呢？
（以上所提到的三个方法请参见下图）
A：
就Lehotay所知，AOAC也赞成去开发一个通用的QuEChERS方法，这样如今通行的两个官方方法就能合并成为一个适应于各种各样食品的方法。
这里面涉及到液固提取时醋酸缓冲液的使用以及基质萃取的净化（包括一次性的吸管萃取――美国DPX实验室的产品）。
基质分散萃取中每毫升提取液加入50mgPSA，50mgC18，7.5mgGCB（加上150mg干燥剂无水硫酸镁）。
对于谷物类样品，每2.5或5g样品，添加10ml水进行提取时，更倾向于使用150mg的PSA。
这个方案仍然需要AOAC去编写与评估。
适用范围的扩大
Q：
虽然QuEChERS刚开始时是针对水果、蔬菜中多农残提取的一个方法，但是现在它已被采用在越来越多领域（比如，兽药，多环芳烃与抗生素）检测越来越多的不同样品（比如血浆、肉、土壤）。
这些方法许并没有像你们以前那样小心地做过室间测试，你们觉得这是否过火了呢？
A：
我们很开心QuEChERS能被扩展使用于不同的领域。
根据方法在工作中的使用效果，要具体问题具体分析，这取决于是否有科学依据，而与QuEChERS自身无关。
在所有新开发的方法中，大家必须要注意评估其效果以及有效性。
从一开始，我们并没有对QuEChERS进行专利控制，首先因为我们觉得化学方法或是基质萃取是不能进行专利控制的（毕竟，在使用毛细管前Tswett已用吸附剂进行色谱分离），其次，只要冷静想想，我们都认为如果不对此进行插手，QuEChERS方法会使用到更多的领域。
我们以及我们的团队都没有从QuEChERS的商品化中得到利益。
为了“保护”QuEChERS，我们所做的就是对国际官方方法的验证以及认证机构（AOAC与CEN）进行支持。
AOAC方法2007.01与CEN标准方法EN15622都是经过验证的方法，其调整后的版本只要经过充分的验证，适合用于还是能得以接受的。
然而，我们注意到在某些方法的开发以及次数有限的验证试验中，加标样品虽然均能得到好的稳定的回收率，但是，对于现实中某些基质与分析物之间作用强烈的样品或者常规分析中出现的仪器维护问题都可能导致例外的出现。
比如，首先值得我们怀疑的就是QuEChERS在土壤分析中的应用，由于这时需要用到更强的提取环境――加压萃取（PLE）或者索氏提取而不是手摇式的萃取，这样才能克服土壤－沉淀物的强烈吸附力。
许多食品中并不会有这么强的作用力，所以手摇式萃取已有令人满意的回收率。
其他用途
Q：
QuEChERS起先被设计用于痕量农残分析，用这技术的实验室以农药实验室为主，这类实验室都非常熟悉代表性样品的采集以及数据统计。
但是现在QuEChERS已被许多非农药实验室用于各种各样的样品作痕量分析。
这类实验室往往缺乏像之前农残分析师那样的经验丰富的专业人士，所以你们认为QuEChERS方法会因为过程中样品采集不具代表性而出现负面评价吗？
毕竟，分析结果的好坏与你所分析的样品是密不可分的。
A：
不错，非但是QuEChERS，其实所有检测方法使用时我们都要考虑其对样品的要求。
无论是在我们最早的论文，还是以后的论文、报告中我们一再强调样品的采集以及均质化是QuEChERS的步骤中密不可分的一环，因为也有利于得到更小的样品颗粒大小以及之后的摇动萃取（shakingextraction）。
可以夸张点说，用于粉碎样品的，市值5000美元的粉碎机要远比30，0000美元的液质重要。
自动化
Q：
农药实验室现在面临着样品量越来越多的问题，QuEChERS过程的自动化也渐渐显得重要。
在通常的试验中，QuEChERS仍然主要是由人手操作，比如手摇萃取和样品操作等。
你们对其以后的自动化是怎么看的呢？
A：
从我们看来，QuEChERS面临的问题不是使其更快更简单，而是使其更便捷，自动化往往会使得样品处理更花时间与精力，甚至还有更高的花费。
一个化学工程师手工处理一批样品往往也会比一个普通人在自动处理机上上样、卸样要快。
幸运的是，当每次只需震摇管子1min时，我们每人还是足以同时应付6～10个提取用的离心管（50ml）的。
然而，实验室的化学工程师们最容易抱怨的其中一个问题还是他们不大喜欢震摇这个步骤（尽管我们建议可以想像着边听音乐边做QuEChERS之舞。
），另外，一部分人的震摇力度也会比一般人弱。
所以，在QuEChERS的萃取过程中能有一台强力的震摇机的确会是一个好帮手，特别是对于一些有能力的实验室来说。
Anastassiades现在正研究食品类样品中农残萃取时，萃取环境的影响因素。
在大部分情况下，1分钟的萃取对此已经足够，但是在某些情况下，增大萃取时间会显著提高萃取的回收。
比如，对于一些农残已扩散到蜡质层结构的样品。
蜡质的颗粒样品明显需要更长的萃取时间才能让被包裹的农残浸泡出来得以提取。
自动化的震摇装置这时就显得有必要了。
然而，基质萃取这个步骤就不需要这种强度的萃取，它只要经过30秒的震摇，因此这也不必自动化。
半自动的DPX装置能同时处理20个样品，其处理量基本与手动操作相当。
如果在此用到自动化装置虽然理论上会减少时间，但是维护成本、仪器停机时间这些因素会与之抵消，这样就显得优势不明显了。
现在样品预处理中已越来越接受QuEChERS――简单的操作步骤、一次就能检测上百种农残。
我们觉得运算软件处理数据后得到的结果，如果这没有经过专人审核，还是不大信得过。
残留化学物分析现在还并不需要像诊断或药物测试（clinicalandpharmatests）那样一次处理那么多的样品量，但是如果QuEChERS得以用与大批量检测，这时自动化就显得十分重要了。
Gerstel（美、英、德）正与DPX等实验室合作去使得QuEChERS能自动化操作。
基质干扰MatrixDependencies
Q：
萃取往往容易受到基质干扰（Extractionsofallkindsareoftenmatrixdependent）。
一个分析方法在这种基质中没问题但是在另外一种基质中就变得有问题了。
对于QuEChERS，你们遇到过这种情况吗？
如果有，可以怎样改良QuEChERS方法去克服呢？
A：
对于农残，食品类样品大部分不会出现基质干扰（某些干燥的、有油脂的样品例外）。
然而，有些复杂样品（比如茶叶、中药、香料、肝脏、柑桔油这类样品）无论你使用什么方法也会存在基质对农残的吸附。
这与方法本身有关，因为如果基质中含有与被测物结构相似的杂质时，很难通过样品预处理过程除去。
当然，通过一些诸如调节萃取剂、PH、加盐、改变体积比、加水、吸附剂等手段也可以起到一定作用。
例如对于PH的影响，Anastassiades就发现要从蘑菇中定量提取尼古丁nicotine时，需要调节PH至10～11。
然而，从洋葱、韭菜中提取百菌清chlorothalonil时，PH就要调至2，这样才能降低基质对其的吸附提高回收率，另外对于沙蚕毒素类的农药相同的低PH值也是必须的。
酸性的除草剂，比如phenoxyalcanoicacids，会易于形成共价键结合的残留。
这类农药在合法使用的农药中属于典型，因此必须在液液提取前把其释放出来。
通常我们可以通过先调节PH到12进行碱解30min（alkalinehydrolysisstep），然后再调回中性进行QuEChERS萃取。
如果是某类的农药，采用针对性强的前处理方法能达到很好的回收，但此时无可避免会降低另外一些农药的回收，在多种类农药提取时这情况难免发生。
对于这些复杂的情况，我们就要靠高质量的色谱－质谱分析。
灵敏度高的仪器能让我们能允许提取液有更低的浓度（比如0.1g/mL），然而高选择性的色谱－质谱仪能使我们忽略与目标物同时出峰的杂质（allowsustolargely'fade-out'matrixcomponentscoelutingwithpesticides）。
当重现性ruggedness与检出限有冲突时（Ifruggednessordetectionlimitsarecompromisedtoomuch），凝胶色谱或者分馏提取液会是一个好的解决方法。
但是这时也要考虑得到的数据需要满足何种要求、试验的时间、成本、劳动力以及仪器设备等各种因素。
我们并不认为QuEChERS无所不能，我们只是认为其快速、易于使用。
如果其能被用上，你会发现其会节省大量的方法开发时间以及工作量。
检测器配套
Q：
QuEChERS提取液可以说是比较脏的。
如果能有高选择性的检测器，比如MS与MS-MS，就能帮助我们在检测中获得高的分析选择性。
对于那些郁闷着正在使用FID的气相色谱与DAD的液相色谱的同行，你们有没有试过推荐他们使用QuEChERS呢？
A：
传统的通用检测器FID与UV-DAD并不足以进行所有的农残分析。
我们必须用一些选择性的检测方法进行补充，比如气相中的FPD、PFPD、NPD、ELCD（electrolyticconductivitydetection）、ECD、XSD（halogen-specificdetection）检测器、液相中的柱后衍生等等。
在LC/MS/MS出现前，较大范围的极性农残是被排除在监控目录下的，这是因为单一的分析方法在实践操作中显得太触襟见肘了cumbersome。
之前的多农残分析方法多是为气相分析设计的，而QuEChERS联合LC/MS/MS就大大提高了农残监控的能力。
在LC/MS/MS或者GC/MS/MS的帮助下，我们在典型样品的分析中很少会出现杂质干扰等情况（除了某些香料和柑橘类植物）。
同样地，QuEChERS结合气相、液相中的选择性检测器对比之前的方法并不能在减少杂质干扰上得到多大的改善。
如前所述，QuEChERS只是能在某些分析方法上被采纳用以调整提取和提纯。
当今GC/MS特别是LC/MS/MS，被认为在对农残的控制上是必不可少的（indispensable）。
许多正被逐渐注意到其毒性并加以销售监管的农药只能被LC-MS进行检测。
我们认为那些为发展中国家建立出口管制实验室提供技术、金钱帮助的团体与其支援其LC-DAD、GC-NPD或者GC-ECD这些设备不如直接帮助其一步升级到LC/MS/MS。
这样做投资虽然巨大，但是这是值得投资的，因为这可以检测到大部分，特别是最重要的那些农药残留，大大提高出口产品获得认可能力，减少产品被拒入境的困境。
（improvingtherecognitionofexportcertificatesandreducingproblemswithconsignment-rejections）
以下是QuEChERS应用中出现的一些特殊问题
Q：
在开始的乙腈萃取中，当加入无水硫酸镁时，会产生一定的热量。
在某种意义上，这些热量能提高萃取速度或者萃取效率，但是另一方面来看，热量太多时，会导致一些热不稳或者易挥发农残的损失。
实际应用中，你们是如何协调这矛盾的呢？
（reconciletheseconflicting）或许，这根本不值一提？
A：
我们已经证明方法对上百种农药、不同的被测物具有良好的回收。
热量或许会对少数之前提及的农药造成潜在的降解，但是酸性的环境有助使得这些农药保持稳定。
当使用冷冻样品时，萃取过后温度反而能非常适中。
对于农药
Q：
我已听闻到目前为止有超过400种农药能在不同的基质分析时能应用QuEChERS提取。
除了平面环状的农药能被石墨化炭黑在分散基质萃取中被强烈吸附外，是否还有其他种类的农药不能（或许回收率会很低）采用官方的QuEChERS方法？
如果有（ifso?
），我们是否有什么对策呢？
A：
Anastassiades与他的同事已经开发了一个数据库，它能允许对在框架下合作或单干的验证试验中产生的回收数据进行系统收集以及在线检索on-lineretrieval（网址为：
http:
//www.crl-pesticides-datapool.eu）
这个数据库当前已经储存了超过150000个关于650多种农药及其代谢物在115种不同食品中的加标回收数据，其也包括了其他普通多农残方法的回收数据，这对于需要及时了解不同农药－食品组合中方法的回收是否正常的检验人员的确是一个好的信息来源。
当然，仍然有许多农药是不能用QuEChERS方法提取的，这些农药传统上一般也是需要用到单独的某个或某类检测方法进行分析的。
（比如，草甘磷glyphosate以及其代谢物AMPA，chlormequat/mepiquat/paraquat/diquat,fosetyl,ethephon,maleichydrazide，中文分别为/缩节胺/百草枯/敌草快，乙磷，乙烯利，马来酰肼）Anastassiades正努力找出适合这类农药的检测条件。
（devise想出、发明）
SPE小柱（SPEcartidges）
Q：
虽然分散基质萃取是QuEChERS中最普通的方法，我注意到有些检测人员，特别在亚洲，却仍然选择类似SPE小柱的装置比如双层填料的小柱（如GCB/PSA）去进行净化操作，这是一种“化学过滤”（chemicalfiltration）。
为什么他们会选用这个方法呢？
你们是怎样看待SPE小柱与分散基质萃取的对比的？
A：
是的，SPE小柱的确会比分散基质萃取更能有效去除杂质（coextratives），但是它会降低某些极性农残的回收，同时也需要更多的时间以及金钱。
我们在考虑用分散基质萃取前，也曾经想过用SPE小柱这类化学过滤的方法，但是无水硫酸镁可能会堵塞筛板。
在分散基质萃取中必须要用到吸水剂dryingagent来把有机层中的水分从7％降到2％（这有助于PSA的净化以及减少进入GC系统中的水分）。
当使用氯化钙代替硫酸镁时会达到更低的水分残留以及更好的净化效果。
这方案已成功用于发酵茶提取物的净化，当然其也有不利之处，对于最高极性的农药甲胺磷methamidophos，会有大概20％的回收损失。
我们也试过用SPE小柱或滤膜的方法，但是最后还是觉得分散基质萃取效果较好。
DPX也是一个选择，它能过滤含有大于2µm颗粒杂质的提取液。
传统的SPE经常被用来进行QuEChERS中的净化，但是我们发现与其相比，在农残的检测上，分散基质萃取能提供更高的回收率，而且操作更快，更简单也更便宜。
许多检测的同行认为SPE是净化的首选，但是只要你们想想，使用传统的SPE，其实也意味着使用真空箱，真空泵，繁多的预处理步骤（活化，上样，淋洗，洗脱），收集管，流量控制，溶剂挥发，小心的操作，还有检验人员需要的费力的方法开发。
分散基质萃取所用的固定相
Q：
你们是否能预期对于分散基质萃取固定相的需求增长或者说当前SPE上用到的固定相以后会移植到分散基质萃取中？
如果能设计所谓的“完美”吸附剂，你们觉得应该要满足什么要求呢？
A：
分散基质萃取中用到的许多固定相都是来自SPE。
对于所谓的完美吸附剂应该能只除去最终提取液中的杂质而不损目标物。
在所有的食品中，这些杂质包括脂肪，碳水化合物，蛋白质，水和少量的金属成份，维生素与因个体而异带来的各种天然产物。
QuEChERS方法中的选择性提取步骤会减少杂质（脂肪，水，蛋白质，糖分）的出现，分散基质萃取步骤的设计就是为了进一步降低残存的，会影响分析从而导致基质效应，减少回收，降低设备重现性（ruggedness）的杂质存在，比如脂肪和其他酸性物质，叶绿素，花青素等其他色素（pigments），甾醇类化合物（sterols），水。
每毫升提取物加入150mg硫酸镁，50~150mgPSA,50mgC18，7.5mgGCB进行萃取是我们所知的对于食品中农残分析的最好分散基质萃取方案，它能在很广的浓度范围提供高的回收率。
采用其他吸附剂，改变其用量，调整PH或许溶剂组成，正已烷去脂，这些步骤可能会使得杂质去除得更好，但是这会降低农残的回收。
分子印记技术（MIPs）能针对性地去除某类杂质成份，在不降低被测物回收的前提下，这是一个很好的补充。
不足之处
Q：
关于QuEChERS优势的说法已经有许多了，但是这个技术的不足之处又有那些呢？
A：
要讨论QuEChERS的缺点或优点，需要跟其他技术进行比较才行。
我们认为QuEChERS的优点是经过许多实验室通过跟其他方法进行比较后得出的，而其缺点更多来自于个人的喜好，就像之前所述，所谓的缺点更多不是来自于其固有的缺陷。
QuEChERS无疑地已经改变了农残分析中样品处理的方法，就算是没有用到QuEChERS的那些实验室，也会在他们的方法中采用离心管萃取或许分散基质萃取这些QuEChERS涉及的技术。
还有一个值得注意的问题Thereisoneissueofnote，在QuEChERS出现之前，农残检测方法得到的提取液中，一般每毫升非极性溶剂相当于含有2～5g的样品，当使用GC/MS（SIM模式）进行不分流进样，进样量为1～3µL时，方法检出限一般为10ng/g。
除非检测人员把提取液再进行浓缩、或许溶剂置换，一般QuEChERS方法得出提取液乙腈中，每毫升相当于只有1g样品。
为了使得其能达到之前方法的检出限，程序升温进样器（PTV，programmabletemperaturevapourization）结合3～10µL大流量进样（LVI，large-volumeinjection）是需要。
北美的许多实验室的气相并不用PTV-LVI，但这技术在欧洲成为标准方法已经
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