IGFBP5基因在山羊生后骨骼肌中的表达研究.docx

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IGFBP5基因在山羊生后骨骼肌中的表达研究

IGFBP-5基因在山羊生后骨骼肌中的表达研究

方涛（动物科学2007级5班）

指导老师张红平教授

摘要：

胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）是胰岛素样生长因子家族的重要成员，对延长胰岛素样生长因子（IGFs）的半衰期和调节其生物学功能起着重要的作用。

本实验采用RT-PCR技术，以南江黄羊为材料，分析了IGFBP-5基因在6个不同的时间点（0d、15d、30d、60d、90d、120d）以及不同骨骼肌组织的表达差异。

结果表明IGFBP-5基因在不同性别间的表达差异不显著（P>0.05）；在同一性别，同一时间点的不同肌肉组织中差异也不显著（P>0.05）。

但在相同性别、同种肌肉组织的不同时间点的表达中，IGFBP-5均呈现出“先上升后下降”的趋势，但在不同的肌肉组织表达量的高峰出现的时间不同。

关键词：

IGFBP-5基因山羊骨骼肌表达差异

ExpressionofIGFBP-5GeneinGoatSkeletalMuscleAfterBirth

Author：

Fangtao（AnimalScienceClass5Grade2007）

Academicadviser：

ProfessorZHANGHongping

Abstract：

Insulin-likegrowthfactorbindingprotein（IGFBPs）wastheimportantmemberofinsulin-likegrowthfactorfamily,whichplayedanimportantroleonextendingthehalf-lifeof（IGFs）andregulatingtheirbiologicalfunction.Inthisstudy,NanjiangYellowIGFBP-5mRNAgenesequencewasclonedbyRT-PCRandexpressiondifferenceswereanalyzedinsixdifferenttimepoints（0d、15d、30d、60d、90d、120d）anddifferentskeletalmuscletissue’s.Resultsshowedthatthedifferencesofthegeneexpressionbetweendifferentgenderswasnotsignificant（P>0.05）,andatthesamesex,sametimeindifferentmuscletissue,itwasnotsignificanteither（P>0.05）.However,atthesamesex,thesamemuscleindifferenttimepoints,alloftheIGFBP-5showed“increasedandthendecreased”,butthepeakexpressionofdifferentmuscletissueappearedatthedifferenttime.

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Keywords：

IGFBP-5gene,goat,skeletalmuscle,expressiondifferences

1前言

1.1IGFBP基因家族概况

胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactorsIGFs）是一类既具有促细胞分化和增殖活性，又具有胰岛素样作用的多肽，包括IGFs（IGF-I和IGF-II）与IGF受体（IGFR）、IGF结合蛋白（IGFBP）、IGFBP酶共同构成IGF系统，在生长发育中起重要作用[1]。

胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）是胰岛素样生长因子家族的重要成员[2]，对延长胰岛素样生长因子的半衰期和调节其生物学功能起着重要的作用，目前已在哺乳动物中发现7种IGFBPs，分别命名为IGFBP1~7[3]。

近年来，随着对IGFs研究的深入，发现IGFBPs在调节IGFs生理效应中起着重要作用，并且IGFBPs还具有独立于IGF之外的生物活性，受到翻译后的多种修饰[4]，其重要的生物学意义越来越受到研究人员的广泛关注。

1.2IGFBP-5的结构及特性

IGFBP-5是IGFs轴的重要成员，完整的IGFBP5拥有252个氨基酸残基，是分子量为29kDa的分泌蛋白。

对比多数哺乳动物的IGFBPs是结构后发现IGFBPs都有3个大小相似的不同特性结构域。

N端和C端的结构比较保守，中间的结构则变化较多，这是IGFBP-5发挥功能的主要区域。

IGFBP-5拥有18个半胱氨酸，12个位于N端，6个位于C端，位置较固定，半胱氨酸间容易形成二硫键。

N端的半胱氨酸相互连接形成两个重叠的二硫键。

第40位到第92位的氨基酸在IGFBP-5表面形成一段疏水区域，是结合IGF的主要部位，其中第68、69、70、73和74位的氨基酸残基对保持IGFBP-5与IGF-I有高亲和性具有重要作用[5]。

1.3IGFBP-5的生理作用

在骨内，具有独特分子结构的IGFBP-5是调节骨内IGF活性的重要分子。

它能刺激成骨细胞的有丝分裂，而骨内的IGFBP-5也受到IGFs和其他激素、生长因子的调节。

Bantista等认为当骨质重塑或骨质受损时，IGFBP-5与骨细胞外基质羟基磷灰石连接从而刺激骨内IGF增多促进成骨细胞增值[6]。

在乳腺内，IGF轴作为重要的调节轴，在调节乳腺上皮细胞的生长、分化和功能方面发挥着重要作用[7]。

IGFBP-5在乳腺癌细胞系中具有决定细胞亚克隆的表型的能力，能增加乳腺癌细胞对其他生长阻滞因子的敏感性以及阻滞细胞凋亡促进生长等作用。

在这些作用中有的需要依赖IGF-I，有的则不需要依赖IGF-I，它是通过细胞内激酶或直接与细胞核结合启动信号转导等方式发挥其作用[8]。

在前列腺内，IGF轴对前列腺的生理机能起着重要的作用，能调节前列腺正常和肿瘤性细胞的生长和分化。

血清IGF-I的升高与前列腺癌的风险呈正相关[9]。

IGFBP-5作为IGF轴的重要一员在前列腺中也发挥着重要作用。

除以上外，IGFBP-5与皮肤受损后启动损伤修复机制是密切相连的，它可促进胶原纤维连接蛋白产生，使纤维母细胞向成纤维细胞分化转移，促进上皮细胞的衰老以及诱导上皮间质化，激活组织纤维溶解酶原激活物等[10]。

1.4IGFBP-5的研究

目前对IGFBP-5的研究还不充分，其激活信号通路而调控细胞凋亡的机制还不确定，但也具有促进细胞凋亡与抗细胞凋亡的功能[11]。

IGFBP-5在体内体外的两种乳腺癌细胞系中过表达将诱导细胞凋亡[12]。

IGFBP-5跟IGFBP-3的功能一样，调节Bax与Bcl-2基因的表达，提高Bax基因和降低Bcl-2基因的表达。

但IGFBP-5蛋白是以一种非细胞核转运的形式来完成促细胞凋亡的功能，因为在稳定的转染子和载体的控制下核内IGFBP-5的水平没有显著的差异。

赵晓枫等在研究中发现猪IGFBP-5编码序列+534处G/A突变，虽然没有造成编码氨基酸的改变，但结果表明它与猪早期生长相关。

实验也认为IGFBP-5和IGF-II结合作用对猪肌肉纤维也有潜在影响，进而和系水力的高低存在相关性[13]。

2本研究的目的与意义

南江黄羊是我国培育的第一个肉用山羊新品种，具有体格高大、被毛黄色、肉用体型明显、生长发育快、繁殖力高、适应性强的特点。

本试验以南江黄羊为试验材料，采用荧光定量PCR法研究南江黄羊IGFBP-5基因在4个组织（背最长肌、臀股二头肌、半膜肌、臂三头肌）、6个不同时期（0d、15d、30d、60d、90d、120d）的mRNA表达变化规律，为进一步研究IGFBP基因家族对山羊骨骼肌的生长调控规律提供依据。

3材料与方法

3.1实验材料

以初生、15d、30d、60d、90d、120d6个时间阶段的南江黄羊为实验材料，屠宰后立即（从屠宰到取样保存，时间小于1h）取背最长肌、臀股二头肌、半膜肌、臂三头肌4个部位（大小约1cm3），装入冻存管后置入液氮中保存，带回实验室贮存于－70℃备用。

样品采集情况如表1。

表1样品采集情况

0d

15d

30d

60d

90d

120d

公（只）

2

2

3

3

3

3

母（只）

2

2

3

3

3

3

合计（只）

4

4

6

6

6

6

总计（只）

32

3.2实验方法

3.2.1总RNA提取

取备好的组织于液氮中研磨，用Trizol法进行RNA提取。

UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（SK1322）来自上海生物工程有限公司。

3.2.2总RNA浓度分析和纯度鉴定

l%的琼脂糖凝胶：

琼脂糖1g，加入1×TBE工作液100ml，微波炉加热至溶化，冷却至60℃，加入GoldView5µl染色，倒胶，待胶凝固后,取少量RNA加入样品孔中，180V电泳8min。

泳毕，置于凝胶图像分析仪Bio-RadChemDOCXRS下扫描并用Qualityone4.6.1软件分析，可见两条清晰的RNA条带（18S与28S核糖体RNA，后者亮度约为前者的2倍），表明提取的RNA质量较好。

对符合要求的总RNA样品，用核酸蛋白检测仪（Bio-Rad公司，USA）在260和280nm下测定吸光度，按A260/A280接近2.0（可接受范围为1.9-2.1）评估总RNA样品纯度。

3.2.3cDNA第一链的合成

（1）RNA变性：

将模板RNA65℃水浴5分钟，立即置于冰上冷却（对容易形成高级结构的RNA可提高逆转录效率）。

（2）按照下表的逆转录体系配制混合液，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5秒钟，简短离心，并置于冰上，如果要做多个逆转录反应，可以将配制好的混合液后分装在单个反应管中，置于冰上。

（3）逆转录反应，先37℃，15分钟；然后98℃，5分钟（酶失活），反应结束后，将所得的cDNA于-20℃保存。

表2RT反应体系

内容

体积

5×RTbuffer

8µl

RTEazymemix

2µl

Primermix

2µl

RNAaseInhibitor

2µl

RNase-freeH2O

18µl

模板总RNA

4µl

总体积

40µl

3.2.4荧光定量PCR引物设计

实验拟扩增山羊IGFBP5和内参基因GAPDH的完整编码区序列，利用Primer3-BLAST软件设计引物，引物由上海生物工程生物技术服务有限公司合成。

3.2.5引物特异性检测

取所有组织经反转录得到的cDNA各1µl，加入到相应的反应体系中，设定退火温度梯度为55℃-65℃，分别对每个基因的熔解曲线进行分析，检测引物的特异性。

同时根据熔解曲线确定每个基因的最佳退火温度（Ct值最小）。

将产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异目的片段。

3.2.6标准品的制备

分别取每个基因（Ct值最小的管）扩增产物溶液10µl，加入90µl去离子水进行稀释，作为原始管。

然后从原始管中取稀释液50µl，加入450µl去离子水进行稀释后作为第一管。

接着从第一管中取稀释液50µl，加入450µl去离子水进行稀释后作为第二管。

如此反复，进行10倍浓度梯度稀释。

各梯度稀释液作为标准品备用。

3.2.7标准曲线的绘制

取10-1～10-10的标准品各1µl加入到相应的反应体系中，在同样的反应条件下（除退火温度不同外）进行扩增。

根据荧光定量PCR仪绘制的PCR动力学曲线，以样品的拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，分别绘制IGFBP-5和GAPDH基因的标准曲线。

3.2.8实时荧光定量PCR

将模板cDNA解冻，取1µl样品建立12.5µl反应体系。

反应体系如表3。

体系配好后彻底混匀，上机，最后通过标准曲线来计算未知样品的起始拷贝数。

反应体系在伯乐iq5荧光定量PCR仪上进行。

检测中为每个待测样品cDNA设置3个重复，对得到的3个Ct值取平均值，以备带入公式进行计算。

反应条件如下：

95℃预变性30s。

然后95℃变性5s，63.5℃退火30s，72℃延伸15s，共40个循环。

熔解曲线分析：

95℃1min，55℃1min。

然后从55℃开始，每个循环温度增加0.5℃，时间为10s，81个循环，整个过程收集荧光。

根据样品荧光曲线和内参荧光曲线的Ct值计算定量结果。

表3PCR反应体系

组成成分

12.5µl体系

2.5×RealMasterMix/20×SYBRsolution

5.65μl

正向引物（10uM）

0.2µl

反向引物（10uM）

0.2µl

cDNA模板

1µl

RNase-freeH2O

5.45µl

3.3统计分析

采用相对定量解析方法，选用GAPDH作为看家基因，对扩增效率达到要求的样品，根据iQTM5（Bio-Rad）自带分析软件计算各基因各时间点的拷贝数，以目的基因mRNA的拷贝数（单个部位的不同时间点/单个时间点不同部位的样品的最大拷贝数设为1）与对应样品内参基因mRNA的拷贝数（单个部位的不同时间点/单个时间点不同部位的样品的最大拷贝数设为1）的比值表示基因mRNA的相对表达量。

运用SAS8.0软件的PROCGLM程序进行最小二乘均数分析，结果以最小二乘均数±标准差表示，用Duncan法进行均数间的多重比较。

4结果与分析

4.1荧光定量引物验证

以反转录DNA为模板，进行PCR扩增，如图1。

片段大小与最初设计引物的片段大小一致，初步验证片段的大小。

对每个基因的PCR产物测序，测序结果跟设计引物的原始序列进行比对，确定每个基因的荧光定量引物的准确性，再进行下一定量试验。

M123

图1IGFBP-5、GAPDH基因的PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳检测结果

注：

M:

MarkerDL2000；1～3:

IGFBP-5和GAPDH的PCR产物

4.2Real-timePCR标准曲线的建立

根据回收的标准品DNA，按照1×10-3~1×10-9的范围梯度内进行IGFBP-5基因及看家基因的定量反应。

得到2条Real-timePCR标准曲线。

GAPDH基因标准曲线的扩增效率在98.3%~98.6%之间，相关系数在0.997~1.000之间，得到的标准的扩增效率及拟合度较好，选择的5个或6个点均匀分布在标准曲线上，可以用于表达量定量的分析。

4.3荧光定量PCR扩增产物的特异性

在荧光定量PCR扩增程序中，设定扩增产物的溶解曲线。

荧光定量PCR反应完成后，将反应产物温度降低到55℃，然后每10sec升高0.5℃，同时实时检测SYBRGreen的荧光信号强度。

随着温度升高，DNA双链打开，荧光信号逐渐降低。

当DNA解链时，荧光信号强度降急剧降，此时的温度为融解温度（Tm）。

对于某一特定的产物，其DNA链的长度和C+G含量决定其Tm，因此其Tm值固定。

通过对扩增产物Tm值分析，可以衡量扩增的特异性。

本研究的各个基因扩增产物溶解曲线（见图2）。

结果表明：

各个基因扩增产物的溶解曲线均为单峰曲线。

表明各个基因的荧光定量PCR扩增过程中，没有非特异性产物和引物二聚体形成，扩增过程的荧光信号均为特异扩增产物的荧光信号。

IGFBP-5和GADPH基因的扩增产物熔解曲线依次分别为（a）、（b）。

（a）

（b）

图2IGFBP-5和GADPH基因的扩增产物熔解曲线

4.4IGFBP-5基因的性别表达差异

IGFBP-5基因的性别表达差异如表4。

在生后0d，背最长肌和臀股二头肌中的IGFBP-5基因表达量在公母之间存在显著性差异（P＜0.05），其他时间点差异不显著（P＞0.05）。

在半膜肌和臂三头肌中，各时间点IGFBP-5基因表达量在性别之间差异不显著（P＞0.05）。

表4IGFBP-5基因在不同性别间的表达量

日龄

Day

性别

Gender

背最长肌

Longissimusdorsi

半膜肌

Semimembranosus

臂三头肌

Musculustriceps

臀股二头肌

Bicepsfemoris

0d

公Male

0.0023±0.0001*

0.0059±0.0004

0.0179±0.0011

0.0049±0.0001*

母Female

0.0008±0.0001

0.0055±0.0004

0.0059±0.0004

0.0005±0.0001

15d

公Male

0.0010±0.0001

0.0011±0.0007

0.0050±0.0002

0.0020±0.0001

母Female

0.0011±0.0002

0.0015±0.0001

0.0020±0.0001

0.0016±0.0001

30d

公Male

0.0097±0.0003

0.0123±0.0003

0.0396±0.0005

0.0135±0.0004

母Female

0.0061±0.0002

0.0196±0.0007

0.0437±0.0012

0.0081±0.0002

60d

公Male

0.0111±0.0003

0.0106±0.0003

0.0097±0.0004

0.0328±0.0006

母Female

0.0909±0.0052

0.0187±0.0009

0.0731±0.0043

0.0663±0.0029

90d

公Male

0.1001±0.0024

0.0309±0.0014

0.0328±0.0012

0.0239±0.0004

母Female

0.0198±0.0008

0.0533±0.0046

0.0663±0.0046

0.0177±0.0012

120d

公Male

0.0165±0.0014

0.0047±0.0003

0.0033±0.0003

0.0014±0.0001

母Female

0.0045±0.0003

0.0023±0.0001

0.0019±0.0001

0.0010±0.0001

注:

*表示不同性别间差异达显著水平（P<0.05），**表示不同性别间差异达极显著水平（P<0.01）。

4.5IGFBP-5基因的组织表达差异

如表5所示，在出生后每个时间点，IGFBP-5基因在各肌肉组织中的表达量差异不显著。

日龄

Day

背最长肌

Longissimusdorsi

半膜肌

Semimembranosus

臂三头肌

Musculustriceps

臀股二头肌

Bicepsfemoris

0d

0.0016±0.0001A

0.0057±0.0004A

0.0119±0.0009A

0.0027±0.0002A

15d

0.0001±0.00004A

0.0001±0.00005A

0.0004±0.00002A

0.0001±0.00003A

30d

0.0079±0.0003A

0.0016±0.0006A

0.0417±0.0006A

0.0135±0.0003A

60d

0.0510±0.0029A

0.0146±0.0034A

0.0414±0.0033A

0.0404±0.0008A

90d

0.0599±0.0033A

0.0421±0.0033A

0.0496±0.0034A

0.0215±0.0009A

120d

0.0105±0.0010A

0.0036±0.0002A

0.0026±0.0002A

0.0010±0.0001A

表5IGFBP-5基因的肌肉表达差异

注：

同行小写字母不同表示数值差异显著（P<0.05）;同行大写字母不同表示数值差异显著（P<0.01）。

4.6IGFBP-5基因表达的发育性变化

由表6和图3可知，背最长肌中IGFBP-5基因的表达量为生后90d＞生后60d＞生后120d＞生后30d＞生后15d＞生后0d，生后90d基因表达量极显著高于生后0d、生后15d和生后30d的表达量（P＜0.01）。

半膜肌中IGFBP-5基因的表达量为生后90d＞生后120d＞生后60d＞生后30d＞生后15d＞生后0d，生后90d基因表达量显著高于生后60d和生后120d的表达量（P＜0.05），极显著高于生后0d、生后15d和生后30d的表达量（P＜0.01），生后120d基因表达量显著高于生后0d、生后15d和生后30d的表达量（P＜0.05）。

臂三头肌中IGFBP-5基因的表达量为生后60d＞生后90d＞生后120d＞生后30d＞生后15d＞生后0d，生后60d基因表达量极显著高于生后15d的表达量（P＜0.01），显著高于生后0d和生后30d的表达量（P＜0.05）。

臀股二头肌中IGFBP-5基因的表达量与臂三头肌中的表达趋势相同，为生后60d＞生后90d＞生后120d＞生后30d＞生后15d＞生后0d，生后60d基因表达量极显著高于其余各时间点的表达量（P＜0.01）

表6IGFBP-5基因的发育性变化

日龄

Day

背最长肌

Longissimusdorsi

半膜肌

Semimembranosus

臂三头肌

Musculustriceps

臀股二头肌

Bicepsfemoris

0d

0.0029±0.0002B

0.0052±0.0005Bc

0.0310±0.0048b

0.0115±0.0011B

15d

0.0046±0.0002B

0.0282±0.0216Bc

0.0625±0.0020B

0.0217±0.0016B

30d

0.0089±0.0003B

0.0306±0.0011Bc

0.0847±0.0019b

0.0333±0.0010B

60d

0.1420±0.0062AB

0.0681±0.0032bc

0.2050±0.0116Aa

0.3152±0.0107A

90d

0.2065±0.0065A

0.1579±0.0070Aa

0.1974±0.0079AB

0.1257±0.0053B

120d

0.1333±0.0031AB

0.1177±0.0073b

0.0932±0.0064AB

0.0650±0.0028B

注：

同列小写字母不同表示数值差异显著（P<0.05）；同列大写字母不同表示数值差异显著（P<0.01）。

图3IGFBP-5基因的发育性变化

注：

1-6分别代表生后0d、生后15d、30d、60d、90d和120d。

A：

背最长肌；B：

半膜肌；C：

臂三头肌；D：

臀股二头肌。

5讨论

胰岛素样生长因子对细胞生长分化具有重要的调控作用，其水平与动物生产性能密切相关。

胰岛素样生长因子结合蛋白是IGFs在体内的特异性结合蛋白，主要通过转运循环中的IGFs，调整IGFs清除率、延长其半衰期、调节IGFs在组织细胞中定位以及调节IGFs与其受体相互作用几个方面来调节IGFs的生物学作用。

因此，可以通过IGFBPs来调控IGFs活性，进而实现对畜