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稳定核素技术
第十一章稳定核素技术
第一节概述
稳定核素分析技术是进行生命科学研究和临床研究一项十分重要的技术。
早在放射性同位素广泛应用之前，稳定核素就被用来进行有关生命科学的研究。
随着稳定核素定量检测技术的飞速发展，特别是气相色谱-质谱联用仪、液相色谱-质谱联用仪和在核磁共振谱仪中采用了傅里叶变换技术，大大提高了测量的灵敏度和精确度，并可分析分子结构；加之稳定核素的产量增加和成本下降，以及人们对放射性危害的关切，使得稳定核素的应用迅速发展。
一、稳定核素测定的特点
与放射性核素相比，应用稳定核素有其特殊的优点：
①没有辐射危害，因而适宜于体内示踪，尤其是孕妇及儿童；使用时不需采用特殊的防护措施。
②稳定核素标记的化合物不会发生辐射自分解，核素也不会衰变，因而不受时间限制，并且适用于长过程的示踪。
③稳定核素一般没有化学毒性，如常用的13C、15N、18O，安全可靠。
④有些核素如氮和氧没有半衰期足够长的放射性核素，稳定核素是唯一可用的示踪物。
⑤用有机质谱仪和核磁共振谱仪分析时，可以观察到示踪物的分子结构及示踪原子标记位置，而使用放射性核素，则需通过复杂的化学降解及降解产物的分离才能确定。
⑥可与放射性核素双重标记示踪来弥补放射性核素单标记的不足。
二、常用的几个基本概念
核素（nuclide）是指具有特定核特征的某一种原子，泛指原子序数、原子量（或叫质量数）和核能态不同的原子形式，核素分为稳定核素（stablenuclide）和放射性核素（radionuclide）两类。
同位素（isotope）是指原子含有相同的质子数，不同的中子数，而致质量数不同但原子序数相同，在元素周期表上占相同位置的化学性质基本相同的那些核素。
由于同位素具有相同的壳层电子结构，因而，同位素的化学性质相同，称为同位素的相似性。
而同位素的相异性表现于原子核结构的不同，即核内中子数不同，因而质量数不同。
利用同位素的质量差异，发展了稳定核素的分析法——质谱法（massspectrometry）。
同位素丰度（isotopeabandance）是指某一同位素在该元素中所占原子的百分含量。
原子百分超（atompercentofisotope）是指在某一元素的标本或某一标记物中，某同位素丰度与该同位素天然丰度之差。
分子丰度（isotopeabandeance）是指每100个分子中带标记核素的分子有多少，其中包括了天然稳定核素形成的标记分子；分子百分超不包括后者。
表11-1列举了常用的稳定核素及其天然丰度。
表11-l几种常用稳定核素的原子量和天然丰度
核素
原子量12C=12.00000
天然丰度（%）
2H
2.014102
0.015
15N
15.000108
0.365
13C
13.003354
1.110
18O
17.999160
0.204
33S
32.971461
0.750
第二节稳定核素及其标记物的测量分析
稳定核素的测量分析，主要包括测定稳定核素的丰度、核质量、标记化合物的结构及示踪原子在标记分子中的位置等。
为此，在经典的质谱法基础上，发展了许多新的化学分离和分析技术，下面逐一作简要介绍。
一、质谱分析法
质谱法（massspectrometricanalysis）是直接测量各种物质的原子或原子团的质荷比（m/z），确定被测原子或原子团的性质和数量。
它是稳定核素最基本、最通用和最有效的分析方法，它不受待测元素种类和物质形态的限制，灵敏度较高,精确度好。
质谱仪种类较多，近年来，仪器和使用的技术都有了巨大的进步。
按照待测样品形式来分类，可分为两类：
一类是同位素比值质谱仪（isotoperatiospectrometer）（无机质谱仪）；另一类是对一些有机物进行定性甚至定量分析的仪器，称为有机质谱仪，此类仪器常与气相层析仪或高效液相层析仪相连接，并与计算机联机，进行数据记录与分析处理，称为气-质联用仪（GC-MS）或液-质联用仪（LC-MS）。
尽管此两大类仪器在设计上有许多差别，但其工作原理是相同的，包括5个主要环节，即样品的准备、样品的电离、离子束流的出射和分离、离子束流的接收和数据处理。
相应地仪器就包括五个主要系统，即进样装置，离子源、质量分析器、检测器和数据处理系统。
当样品通过进样装置进入离子源之后，经过离子源中物理和（或）化学的作用，成为带电荷的离子。
带正电荷的离子随后进入质量分析器中，根据这些离子的质量与电荷的比值（质荷比，m／z）的不同，分离成为许多单一质荷比的离子束。
这些离子束再逐步被检测器所检测，然后再通过数据分析系统分析和储存。
（一）质谱仪的基本部件
1．离子源
离子源将被分析物电离成离子，并经过电极系统加速到一定能量，聚集成具有一定能量的离子束，进入质量分析器。
在进行核素质谱分析时，根据样品的形态和性质，一般按下列原则选用离子源：
电离效率高，离子的初始能量分散小，离子流稳定，离子束流传递效率高，本底低，记忆效应小，工作气压范围宽，质量歧视效应小等。
常用电离方式有电子轰击电离、热表面电离和化学电离。
电子轰击电离是利用几十电子伏的慢电子轰击进入离子源内的气体样品，使样品原子或分子失去电子而形成正离子，或使其捕获电子而形成负离子。
由于此种电离方式可以电离一切气（汽）体物质，重复性好，因此，这种离子源在质谱仪中最常使用。
热表面电离源是根据难以气化的固体样品中的原子或分子接触热金属表面产生热离子发射的原理制成。
这种电离方式对碱金属有较好的灵敏度，但是各种元素的电离效率相差太大。
化学电离是先用电子轰击反应气体，使之生成初级离子，初级离子再与气体样品通过离子-分子反应即大量的反应气体离子与少量样品分子产生碰撞，而生成样品离子。
例如，用甲烷作反应气体的主要电离过程如下：
CH4+eCH4++2e
CH4++CH4CH5++CH3
CH5++样品分子样品分子-H++CH4
用这种离子源分析多原子化合物，易获得分子离子峰，而碎片峰少，谱线单纯。
常用的反应气体是CH4、H2、NH3、C3H8等。
在气-质联用仪中，可以直接用层析载气作反应气体。
近年来，离子源的研究发展较快，除上述离子源外，还有场解析电离、场致电离、激光电离、快原子轰击电离等多种。
它们适用于不同的场合。
2.质量分析器质量分析器的作用是把总离子流中不同质量的离子分离成单一质量的离子束。
最常用的是磁偏转式质量分析器，它又分单聚焦和双聚焦两种，此外还有一种常用的质量分析器，称为四极滤质器。
磁偏转式质量分析是设置一个扇形的磁场（单聚焦）或者加上电场（双聚焦），当离子束通过磁场时，带电离子在磁力作用下而发生偏转。
离子偏转角度（曲率半径R）、加速电压V、磁场强度H及离子的质荷比（m／z）有以下函数关系：
（11.1）
由函数（11.1）可知，对于不同m／z的离子，只要调节磁场强度H和加速电压V，就可以使它们在磁场中的偏离角度（或曲率半径R）相同，从而可以逐个记录下同离子的电流强度。
这一过程称为扫描过程，改变H称为场扫描，改变V称为电扫描。
为了适合有机大分子化合物的质谱分析，提高分辨率，现代有些有机质谱仪采用静电场和磁场组合成的方向和能量双聚焦分析器，以消除入射离子能量分散的影响，称为高分辨率质谱仪。
图11-1是一个四极滤质器示意图。
四极滤质器是一种采用射频电场来实现质量分离的非磁性分离器。
它有两对具有极性相反、幅值相同的射频电压的杆状电极，可以使一定质量数的离子在射频场中作稳定的振荡运动而到达检测器；而其他质量数的离子因振幅不断增加而被电极吸收。
通过改变电压频率或电压幅值，而实现对不同质量离子的分离。
此分离器常用于气-质联用仪，具有体积小、重量轻、扫描速度快、灵敏度高、结构简单、价格便宜的优点。
图11-1四级场质量“滤过”
3.离子检测器
离子检测器的作用是对通过质量分析器的离于强度进行定量测定。
常用一般为法拉第筒离子检测器,可以检测到的最小离子流强度为10－15A，而电子倍增器可达10－19A。
后者适用于分析复杂的有机化合物。
（二）质谱仪的常用性能指标质谱仪的性能常用以下指标来描述:
1.分辨率质谱仪的分辨率表示对相邻两个质谱峰的分离能力，通常用下式表示：
（M1为峰1的m/z,M2为峰2的m/z）（11.2）
一般两个相邻峰重叠处（峰谷）的高度不超过峰值的10％，两个峰就可以分开，见图11-2。
根据分辨率的高低，把质谱仪分为低、中、高3档,即分辨率>10,000的为高分辨率；分辨率500～5000的，为中分辨率；<200的为低分辨率。
图11-2质谱分辨率示意图
2.质量范围指仪器能够分析多大原子量（或分子量）范围的样品，以质量单位来度量（amu）或质量数、质荷比来度量。
一般有机质谱仪的质量范围较大。
3.探测灵敏度指仪器检测所需最小样品量，即完成一次分析使用样品的最小数量。
4.丰度灵敏度
指所能检测的质量数为M的离子束流IM与它在相邻质量数位置M＋1或M－1上拖尾
Im＋1或IM－1的比值，即丰度灵敏度IM/IM±1。
它实际上表示仪器对同位素丰度的感测力。
5．精密度
指测定值间的标准偏差或变异系数，表示仪器获得数据的重复性。
6．准确度
指实测值与真值偏差的指标。
（三）同位素样品的质谱分析
1．固体样品的同位素质谱分析
固体同位素比值质谱仪常采用带状热表面电离源。
样品物质的化学形式常选用它的硝酸盐、硫酸盐、卤化物、氧化物和氢氧化物等。
样品制备是取一定量的样品，转化成选用的化学形式，加蒸馏水或稀酸配成真溶液或细颗粒状悬浮液，用吸液管滴在表面电离源的样品带上。
涂样要求均匀、接触充分。
当质谱仪的离子源的分析室真空度达1.3×10－5Pa时，就增加电流升温，然后寻找待测同位素的离子流，并测定其强度。
2．气体形式样品的同位素质谱分析
气体同位素比值质谱仪通常采用电子轰击电离方式电离并采用双路进样系统。
即一路输入待测样品，另一路输入标准品，以便于进行比较测量。
气体进样有分子流进样与粘滞流进样两种，其相应的气流状态为分子流和粘滞流。
各种生物样品组成非常复杂，在进行质谱分析时，必须使用一系列手段，将样品转化成为合适的气体形式，才能进行。
常见的气体有H2、CO2、N2和SO2。
这种样品处理过程，不能发生同位素组成的变化；同时其转化过程必须是完全的，也不应该有任何外来气体污染。
常用的样品制备方式如下。
（1）含碳同位素生物样品制备方法用燃烧法把碳转化成CO2气体。
它是用CuO作为氧化剂，用氧化钡吸收生成的CO2气体。
分析时再用酸作用释放出CO2，也可用浓硫酸氧化生成CO2气体。
（2）含氮同位素生物样品制备方法用凯氏法或杜氏法将含氮同位素样品转换成N2。
凯氏法是将生物样品溶于硫酸，然后使用真空系统制备N2（质谱仪一般附有氮的制备装置）。
杜氏法是将生物样品放入氧化铜（加入少量钢），直接生成N2。
在还原过程中加入氧化钙，吸收同时生成的水和CO2。
13CO2呼气实验时,可以用碱性物质吸收13CO2,或直接用气体容器收集13CO2。
（3）含氧同位素样品制备方法一般是在含氧同位素的生物样品中加入镀有10％～15％镍和15％～30％铂的活性碳，同时加入蒽作辅助还原剂，在1,050℃条件下使有机物快速燃烧而生成CO2气体。
（4）含氯同位素样品制备方法常将生物样品转化成水的形式，如有机物可先经过燃烧，转化成水，然后将水还原为H2。
（5）含硫同位素样品制备法在样品中加入AgCl，同时加入CuO，在升温条件下生成SO2。
应用气体同位素比值质谱仪进行同位素样品分析的历史较悠久，分析技术较成熟，仪器构造简单，同时测量精度较高。
但是，此项分析技术的最大缺陷在于不能获得生物样品中分子结构的信息。
3．有机同位素样品的质谱分析
有机质谱仪可以直接对有机化合物同位素丰度进行测定。
其基本工作原理与气体同位素比值质谱仪相同。
它的电离方式则是在离子源内将有机化合物或其衍生物气化后再使之电离，形成分子离子，它保持了化合物复杂的结构。
此外，有些化合物分子在电离时按一定规律发生裂解，形成其特征碎片离子。
成分单纯的样品可以直接通过进样系统进入电离室，而成分复杂的样品必须先经过气相色谱仪或液相色谱仪的层析分离（即GC-MS，LC-MS），然后依次进入离子源，在离子源中电离，形成总离子流（TIC），TIC进入质量分析器被分离成为单一质量的离子束流，再通过扫描方法进行探测，并记录下来，得到其质谱图。
根据质谱图的分子、离子和碎片离子分布可对待测化合物定性；而根据有关峰值的离子强度，可判断标记部位、标记原子数，计算标记分子的丰度。
由于质谱法中所应用的稳定同位素的质量大于其天然元素，因此当某离子峰含有这种标记同位素时，其m／z必然增加，同位素原子含量越高，其峰的强度就越大。
这就是质谱法对同位素定量的根据。
一般在对同位素进行定量分析时，首先确定特征峰。
其标准主要是特征峰为该化合物特有，并包含有欲对其进行定量的同位素原子；该峰强度要足够大，并且最好该峰前后不存在因失去或俘获一个质子而形成的M－1或M＋1峰
待测物同位素丰度计算方法有两类，一为直接计算法，一为坐标法。
（1）直接计算法一般采用Biemann的方法。
基本原理是设一个非标记分子，其特征峰的m／z为M，同位素比其天然元素重一个原子质量单位，这个非标记分子中含有一定比例的天然同位素而形成少量M＋1、M＋2…等峰的几率与标记分子由于天然同位素而形成的M＋l′、M＋2′…等峰的几率相同。
同时选择条件，去除由于失去或者俘获一个质子而引起的M＋1或M－l峰。
这样，就可以根据非标记物的质谱数据算出标记物质谱数据中由于天然同位素引起的M十1′、M十2′…的离子强度，从而将测得的标记物数据分解算出含1、2…个标记原子的分子各占的比例数。
例如，对某一非标记物测定得到的M十1／M＝0.0663，M十2／M=0.0037，而对某标记物进行测定的结果为：
质量MM十1M十2M＋3M＋4M＋5
峰强250570910650422.0
M全部为非标记分子贡献，算出由标记分子对M十1、M＋2的贡献，并将其分别从标记分子的M＋l、M＋2中扣除。
250×0.0663＝16.575，250×0.0037＝0.925
得到结果：
质量M+1M＋2M＋3M＋4M＋5
峰强553.425909.075650422.0
在M十1处由于单标记对峰强的贡献为553.425。
它对M十2、M十3的贡献计算如下，并分别扣除。
553.425×0.0663＝36.692，553.425×0.0037＝2,048
得到结果：
质量M十2M十3M十4M十5
峰强873.383647.952422.0
在M＋2处由双标记对峰强的贡献为872.383。
它对M＋3和M＋4的贡献计算如下，并分别扣除。
872.383×0.0663＝57.838，872.383×0.0037＝3.227
得到结果：
质量M＋3M＋4M十5
峰强590.11438.7732.0
在M＋3处由于三重标记对峰强贡献为590.114。
它对M＋4和M＋5的贡献计算如下，并分别扣除。
590.114×0.0663＝39.12，590.114×0.0037＝2.18
得到结果。
质量M＋4M＋5
峰强-0.347-0.18
由此可知，不包含有3个以上的标记原子，将上述得到的真值相加：
250＋553.425＋872.383＋590.114=2265.922
不同标记的丰度如下：
单标记丰度：
553.425／2265.922×100％＝24.42％分子
双标记丰度：
872.383／2265.922×100％＝38.50％分子
三标记丰度：
590.114／2265.922×100％=26.04％分子
（2）坐标法以一系列不同丰度的已知样品作标准曲线，再以各样品的质谱数据从标准曲线上换算出同位素丰度。
此法简单，不受由于俘获一个质子而引起的M＋1峰的影响。
例如，15N-脯氨酸的测定，可先以一系列已知丰度的15N-脯氨酸样品制成标准曲线。
如图11-3所示，非标记的14N-脯氨酸衍生物的特征峰为m／z166，而标记15N-脯氨酸衍生物的特征
图11-315N-脯氨酸标准曲线
峰为m／z167。
这样，以质谱峰值比I（m/z167）／I（m/z166）×100％为纵坐标，以15N-脯氨酸／14N-脯氨酸摩尔数×100％为横坐标，得到一条直线关系的标准曲线。
由此通过测量并查标准曲线得出样品的同位素比值R即横坐标数据后，就可以通过下式算出同位素丰度A。
（11-3）
在此方法中，由于测量过程俘获一个质子生成的m／z167峰，只影响了标准曲线截距的变化，对计算结果没有影响。
（四）核素质谱分析法的特点
质谱法是核素分析最常用和最有效的方法，它具有以下特点：
（1）它几乎可以分析所有元素的同位素，可以使用气、液、固3种形态的样品。
（2）质谱分析法的精度高，其他方法无法与之相比。
（3）它可与其他类型仪器如气相层析仪、液相层析仪相连，并用计算机控制。
（4）它可以提供原子量、分子量、同位素丰度、标记化合物同位素含量等多种数据。
但是，质谱分析法仍然有一定的局限性，首先表现在进行高灵敏度同位素质谱分析时，受样品制作和操作过程中污染的影响；其次是质谱仪价格昂贵，操作技术复杂，使广泛应用受到限制。
二、核磁共振法
核磁共振法是利用1～102MHz的电磁波照射置于强磁场中的样品，样品中的某些原子核在特定的磁场强度下，与照射电磁波发生共振现象，产生各种强弱不同的吸收信号，以此判明某些核素在分子中所处位置及某些功能团上核素的相对数目。
这项技术已经有效地应用于有机化合物的定量分析和分子结构的研究。
应用最广泛的是质子（1H）核磁共振波谱。
原子核是带电荷的粒子，自旋量子数（I）不为零的核称为有旋核，有旋核自旋时，必然伴有磁矩。
如果把这样的核置于均匀磁场中，核的自旋轴就要定向排列，一个原子核在磁场中共有（2I+l）个取向。
有旋核在均匀磁场中作自旋运动的同时，还要顺着磁场的方向运动，称为Larmor进动，根据Larmor公式：
ωo＝2π，υο=γHo（ωo为角速度，υο为进动频率，γ为旋磁比，Ho为外加磁场强度）。
公式转换成：
（11．4）
如果在外加磁场的垂直方向加一个频率可调的电磁波，当此电磁波的频率（υ1）刚好等于有旋核的进动频率时，即υ1=时，就发生共振现象。
共振时，原子核从一个取向改变到另一个取向，称为跃迁，这时原子核吸收或释放出一定能量。
共振核吸收或释放部分能量，从一种状态跃迁到另一种状态，产生吸收峰。
这样，就可以通过固定磁场改变照射频率或固定照射频率改变磁场强度来测量吸收峰强度。
实验表明，吸收谱线的宽度是由核周围状况决定的，吸收谱线的高度则取决于所测样品分子的原子核的数量，以及样品的温度、旋磁比（γ）。
所以当恒定温度时，参与吸收的原子核数目越多，旋磁比越大，谱线的强度就越大。
在实验中，会发生化学位移现象，因为在外加磁场作用下，核周围的电子会产生微弱的局部磁场（H1），这样发生共振时磁场等于外加磁场（H0）与局部磁场之和（H0十H1），称为壳层电子的屏蔽效应。
在作氢核测量时，不同的功能团及其异构体的氢核，屏蔽效应的影响是不同的，因而导致核磁共振峰的位置不同，这种位置上的差异称化学位移。
由于化学位移，使谱线发生分裂，分裂的数目与核的结合状态有关。
利用化学位移，可以一个原子核的吸收峰位置移动，来推断此核的结合状况和它属于何种原子团，以此进行化学分析和分子结构测定。
当用高分辨率的波谱仪观察某些化合物时，谱线还会有更超精细的结构，这是由于核与核之间发生自旋耦合作用，而导致谱线增多即自旋劈裂。
核磁共振法有其特殊的优点，它可以深入物质内部，不破坏样品，提供各种参数等，为测定生物分子的分子量和分子结构提供可靠的依据。
但是，对于自旋量子数大的核素，因为自旋-自旋耦合，造成谱线分裂，使谱线异常复杂，需要高分辨的仪器才能鉴别。
目前常研究的核素有1H、11B、13C、19F、31P等。
三、发射光谱法
原子的价电子或其他壳层电子在基态轨道上运动，处于最低能态。
当原子被一定能量所激发时，壳层电子从低能级向高能级跃迁，这种被激发的原子不稳定，很快就返回到基态，并以发射光波的形式释放能量。
不同元素的原子或分子，在相同能量激发下，所处的激发态不同，因而电子跃迁所发射的光谱波长不同；而同一元素的各个同位素由于质量不同，核外的电子结构不完全一样，激发后所处的激发态不完全相同，因而在电子返回低能级时，所发射的光谱的波长稍有不同，称同位素位移。
各同位素都有各自的特征光谱，用高分辨的摄谱仪即可拍摄或记录这种同位素光谱。
发射光谱的定性分析就是将某些元素或同位素的光谱与标准谱线对照，以鉴定被测样品的元素或同位素。
它只能鉴定被测样品中是否存在感兴趣的元素或同位素，不能说明含量的多少。
一般有机物的组成复杂，谱线极乱，难以分析，同时必须熟悉各种核素的标准特征光谱。
发射光谱的定量分析就是从所记录的特征光谱线的强度来确定元素或同位素含量的多少。
经典的记录方法是使用感光板，用谱线黑度来度量；而先进的发射光谱仪，可以用光电记录仪，记录下光谱强度。
发射光谱法的最大特点在于方法简单，设备耗资少，分析速度快。
同时，它不受样品杂质的影响，样品不要先纯化。
但是它的精确度差。
因此，主要用来作元素的定性和定量分析。
最常用于分析15N。
四、中子活化分析法
稳定核素在一定能量的中子、带电粒子，或者高能γ射线的照射下，经过核反应生成放射性核素，而这种感生放射性核素又都有特定的半衰期，并放射一定特征的射线。
稳定核素不同，所生成的放射性核素及放出的射线种类和能量也不同，而且，稳定核素越多，则生成的放射性核素越多，其射线强度也越强。
这样，就可以通过对放射性核素射线能谱和强度的测量来鉴别稳定核素并测定其含量。
中子活化分析是活化分析中应用最广泛的，其核反应大多数是（n，γ）、（n，p）或（n，α）等。
中子活化分析的灵敏度高，如热中子活化分析对80多种元素的分析灵敏度达到10－6～10-11g，同时活化分析的速度快，可进行自动化分析。
其最大的优点在于可以同时测定同一样品中几种到几十种元素，尤其在进行超微量分析时，不易出现油污，也不受杂质干扰的影响。
有关活化分析的详细内容在本书第九章中已介绍。
第三节稳定核素分析在生物医学中的应用
稳定核素技术在生物医学中已经得到了一定范围的应用，并具有许多独特的优越性。
但是，在应用过程中，也应当注意几个重要问题，以避免分析结果的不准确。
首先，在稳定核素分析中，本底是最常见的问题。
它有两种含义，一是指同位素的天然丰度，有些同位素的天然丰度是非常高的；另外是指仪器分析过程中，在模拟实际分析的条件下，在感兴趣的质量区段内出现的质谱峰，它不由待测物质所贡献。
其次，同位素污染是影响样品分析结果的一个重要原因，它包括高丰度样品对低丰度样品的污染，也包括了天然核素对其同位素样品的稀释。
第三，应当注意同位素效应造成的偏差。
同位素效应是指因同位素质量的差异而引起的物理、化学及生物性质上的差别，尤其在核素示踪实验中，同位素效应有时对实验结果造成较大的影响。
第四，标记原子的丢失，将使实验结果出现误差。
因此，使用的标记物应当是稳定的。
第五，注意所用示踪剂的剂量。
因为没有放射危害，在稳定核素示踪实验中，所用示踪剂的剂量都较大，因而在进行动力学计算时，需扣除标记同位素的剂量。
在进行药物实验时，要注意由于示踪物对人体的影响，及人体对药物的耐受导致的结果误差。
一、稳定核素稀释法及应用
（一）稀释法的原理与方法
稳定核素稀释法的基
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