大肠杆菌弗氏柠檬酸杆菌感染斑马鱼研究.docx
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大肠杆菌弗氏柠檬酸杆菌感染斑马鱼研究
本科生毕业论文（设计）
论文题目：
大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌
感染斑马鱼研究
姓名：
院系：
生命科学学院
专业：
生物技术
年级、班组：
06级3
（1）班
指导教师：
毕业论文（设计）任务书
设计（论文）题目细菌感染斑马鱼研究
专业、班级生物技术06生31学生姓名
指导教师姓名、职称下发日期2009年12月1日
（任务起止日期：
2009年12月1日至2010年5月30日）
设计（论文）的主要内容与要求及其主要技术指标：
主要内容：
本实验以斑马鱼为研究对象，用细菌感染斑马，连续观察一个星期，统计致死率。
主要技术指标：
1.静水式试验
2.细菌对斑马鱼致病性症状的观察及记录
3.获得一星期的LC50
进度安排
序号
毕业设计（论文）工作进度
日期（起止周数）
%
1
收集有关实验资料，材料及实验方法摸索
4月14日－19日
5
3
细菌对斑马鱼致病性的预实验
4月27日—30日
10
4
细菌对斑马鱼致病性的预实验
5月3日－9日
10
5
细菌对斑马鱼致病性的预实验
5月11日—13日
10
6
细菌对斑马鱼致病性的预实验
5月14日—15日
10
7
细菌对斑马鱼致病性的预实验
5月16日—17日
20
8
细菌对斑马鱼致病性的正式实验准备
5月18日
5
9
细菌对斑马鱼致病性的正式实验
5月18—20日
5
10
完成实验总结和毕业论文
5月
15
同组设计（论文）者：
系意见：
签字：
年月日
学院负责人意见：
签字：
年月日
注：
1.此任务书由指导教师填写。
2.此任务书最迟必须在第七学期16周之前下达给学生。
3.此表由院收集存档，以备教务处检查。
本科生毕业论文（设计）
开题报告书
论文题目：
大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌
感染斑马鱼研究
姓名：
院系：
生命科学学院
专业：
生物技术
年级、班组：
06级31班
指导教师：
毕业论文（设计）开题报告表
课题题目
大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌感染斑马鱼研究
指导教师
职称
副教授
课题组成员
毕业生年级
06生31
完成时间
2010年4月14日
立
题
依
据
1．研究的目的和意义
目的：
检测弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌，对斑马鱼的致病性，并获得致死温度和致死剂量。
意义：
斑马鱼是一种亚热带观赏鱼类，具有个体小，产卵周期小，产卵量高，体外受精与发育等特点，同时由于其与人类基因组具有较高相似性，也具有较完整的获得性和天然细胞免疫系统。
本实验以斑马鱼为模式动物，分析大肠杆菌的的致病性。
2．国内外研究进展及分析
大肠杆菌（Escherichiacoli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。
周身鞭毛，能运动，无芽孢。
大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。
培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。
大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
人体与大肠杆菌的关系：
在不致病的情况下（正常状况下），可认为是互利共生（一般高中阶段认为是这种关系）；在致病的情况下，可认为是寄生。
该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。
在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。
当前大肠杆菌病给养禽业带来的损失越来越大，其难于治愈、死亡率高、极易复发等临床特点，正困扰着基层广大养殖户和兽医工作者。
大肠杆菌具有很多毒力因子，包括内毒素，荚膜，〣型分泌系统，黏附素和外毒素等。
立
题
依
据
弗氏柠檬酸杆菌革兰氏阴性，通常以周生鞭毛运动。
兼性厌氧。
有呼吸和发酵两种类型的代谢。
在普通肉胨琼脂上的菌落一般直径2～4mm，光滑、低凸、湿润、半透明或不透明，灰色，表面有光泽，边缘整齐。
偶尔可见粘液或粗糙型。
氧化酶阴性。
接触酶阳性。
化能有机营养，能利用柠檬酸盐作为惟一碳源。
硝酸盐还原到亚硝酸盐。
没有赖氨酸脱羧酶。
不产生苯丙氨酸脱氨酶、明胶酶、脂肪酶和DNA酶。
不分解藻朊酸盐和果胶酸盐。
发酵葡萄糖产酸产气。
甲基红试验阳性
3．主要参考文献
[1]康白.与正常微生物群有关的新概念.中国微生态学杂志,1992,4（4）:
1-5
[2]桂远明,何幽峰,吴垠等.生态制品（Jy10、Jy31复合制剂）饲料添加剂对提高鲤抗病力的研究.中国微生态学杂志,1994,6（6）:
27-33
[3]JesseDM,MelodyNN.Zebrafishasamodelhostforstreptococcalpathogenesis.ActaTropica,2004,91
（1）:
53-68
[4]PressleyME,PhelanIIIPE,EckhardWP,etal.Pathogen-esisandinflammatoryresponsetoEdwardsiellatardainfec-tioninthezebrafish[J].Developmental&ComparativeIm-munol,2005,29（6）:
501-513
[5]陈 阳,吴 迪,陈雪燕,赵焕灿,扈鸿霞,CheickADiakite,方维焕*猪链球菌2型分离株对野生斑马鱼的致病性*动物医学进展,2008,29（6）:
1-5
[6]濮俊毅，黄新新，陆承平，2007用斑马鱼检测猪链球菌2型的致病力，中国农业科学40（11）:
2655-2658
研究内容
研究的主要内容：
1.弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌对斑马鱼毒性的实验
2.获得弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌对斑马鱼的致死率
3.实验期间斑马鱼的观察及记录
技术路线
和实施方案
1．购买斑马鱼，置于蒸馏水中饲养，同批次斑马鱼驯养一周。
2．参照参考文献，分批设计不同预实验浓度，温度大肠杆菌。
3．针对预实验结果，设计正式试验的浓度，温度。
保证实验条件与预实验及以下实验操作时条件一致。
4．实验开始后开始观察斑马鱼，记录鱼死亡数目，时间，并及时清理死鱼。
5．实验期间连续充气
预期结果
1.预实验获得实验的浓度，温度。
2.正式实验获得致死剂量。
3.获得鱼在试验期间各种现象，整理实验数据，计算结果。
4.撰写毕业论文一篇。
指导教师意见
（签名）年月日
院系意见
（签名）年月日
大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌感染斑马鱼研究
摘要：
以野生斑马鱼为实验动物模型，分别采用大肠杆菌（Escherichiacoli）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacterfreundii），以细菌浓度108-1010cfu之间，在25℃、28℃饲养条件下进行感染试验。
结果表明，斑马鱼在25℃时，大肠杆菌浓度4.0×108的感染致死率为66.7%，半致死时间（LT50）为48h；浓度为4.0×109致死率为66.7%，LT50为20h；浓度1.6×1010致死率为100%，LT50为7min；在28℃，大肠杆菌浓度为4.0×109致死率为66.7%，LT50为15h；浓度为8.0×109致死率为66.7%，LT50为9h。
弗氏柠檬酸杆菌浓度4.0×1010时25℃致死率为66.7%，LT50为27h；浓度2.0×1010时，28℃致死率为66.7%，LT50为20h。
以上结果表明大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌可以感染斑马鱼，并与饲养温度，菌液浓度有关。
关键词：
大肠杆菌；弗氏柠檬酸杆菌；斑马鱼；致死率
EscherichiacoliandcitrobacterfreundiiinfectionofthezebrafishExperimentalStudy
Abstract:
WildzebrafishasexperimentalanimalmodelswereusedtoE.coli（Escherichiacoli）,Citrobacterfreundii（Citrobacterfreundii）,tobetween108-1010cfubacterialconcentration,in25℃,28℃keepinginfectionundertheconditionsoftest.Theresultsshowthatzebrafishat25℃,theconcentrationof4.0×108E.coliinfectiondeathratewas66.7%,medianlethaltime（LT50）is48h;concentrationof4.0×109deathratewas66.7%,LT50was20h;concentrationof1.6×1010deathratewas100%,LT50was7min;at28℃,E.coliconcentrationof4.0×109deathratewas66.7%,LT50was15h;concentrationof8.0×109deathratewas66.7%,LT50was9h.Citrobacterfreundiiconcentrationof4.0×1010whenthedeathrateof25℃66.7%,LT50was27h;concentrationof2.0×1010hours,28℃deathratewas66.7%,LT50to20h.TheseresultssuggestthatE.coli,Citrobacterfreundiicaninfectzebrafish,andwithraisingthetemperature,bacteriaconcentration.
Keywords:
Escherichiacoli;citrobacterfreundii;zebrafish;Infection;Fatalityrate;
引言
本实验中所使用的大肠杆菌来自于健康禽类的肠道，肠道菌群的组成是多种多样的，而且每种细菌的数量及分布各不相同。
肠道内的细菌根据所起作用可以分为原籍菌群（Autochthonousflora）和外籍菌群（Allochthonousflora），或分为固有菌群和非固有菌群等[1]。
弗氏柠檬酸杆菌来自于鱼类肠道。
鱼类对原籍菌群及外籍菌群的免疫作用是不同的。
当肠道菌群进入斑马鱼肠道中，一些适应于肠道环境的种类（一般为厌氧菌）在肠道内成为优势种群，定植下来成为原籍群。
所以寄主的免疫活性细胞并不将它视为“非己”，因此并不引起或仅产生低水平的免疫反应。
相反，鱼类对外籍菌群的免疫反应是强烈的。
侵入人、动物体内的外籍菌很容易引起宿主产生抗体和致敏的免疫活性细胞。
鲤进食生态制品后，免疫力增强，其白细胞吞噬率、白细胞吞噬指数、E玫瑰花环形成率等指标明显高于对照组[2]
大肠杆菌（Escherichiacoli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。
周身鞭毛，能运动，无芽孢。
大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。
在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。
当前大肠杆菌病给养禽业带来的损失越来越大，其难于治愈、死亡率高、极易复发等临床特点，正困扰着基层广大养殖户和兽医工作者。
大肠杆菌具有很多毒力因子，包括内毒素，荚膜，〣型分泌系统，黏附素和外毒素等。
弗氏柠檬酸杆菌（citrobacterfreundii）革兰氏阴性，通常以周生鞭毛运动。
兼性厌氧。
有呼吸和发酵两种类型的代谢。
在普通肉胨琼脂上的菌落一般直径2～4mm，光滑、低凸、湿润、半透明或不透明，灰色，表面有光泽，边缘整齐。
偶尔可见粘液或粗糙型。
氧化酶阴性。
接触酶阳性。
化能有机营养，能利用柠檬酸盐作为惟一碳源。
硝酸盐还原到亚硝酸盐。
没有赖氨酸脱羧酶。
不产生苯丙氨酸脱氨酶、明胶酶、和DNA酶。
不分解藻朊酸盐和果胶酸盐。
发酵葡萄糖产酸产气。
甲基红试验阳性。
弗氏柠檬酸杆菌对河蟹的病原性、并导致其病理变化，药物对该菌的敏感试验及生产中药物治疗效果。
从垂死的病蟹肝胰脏中分离得到可疑病菌，经人工感染试验证实此菌导致健康蟹发病死亡。
该菌可导致河蟹的肝胰腺、鳃等发生病理变化，最终引起败血症而死亡[10]。
斑马鱼（Daniorerio）是一种亚热带观赏鱼类，具有个体小、产卵周期短、产卵量高、体外受精与发育等特点，同时由于其与人类基因组具有较高相似性，也具有较完整的获得性和天然细胞免疫系统[3]，是国际标准化组织推荐的五大试验鱼种之一，试验得出的数据可以在国际上被认可。
斑马鱼作为遗传学、发育生物学研究的模式生物已经得到了较为广泛的应用[4]。
斑马鱼亦存在着较为完整的特异性免疫系统[5]，而且体本实验以斑马鱼为实验动物，为今后可以通过控制水体的微生物的组成来提高鱼苗的成活率，或人为地添加某些定植力强的有益菌群，令其在鱼苗肠道内产生一定的定植抗力，从而为达到提高鱼体抗病力的目的提供一定的科学参考。
1材料与方法
1.1主要试剂
磷酸二氢钠产自于合肥工业大学化学试剂厂，蛋白胨产自北京双旋微生物培养基制品厂，牛肉浸膏来自于国药集团化学试剂有限公司，氯化钠来自无锡市亚盛化工有限公司，磷酸氢二钠来自于合肥工业大学化学试剂厂，琼脂粉来自于天津市福晨化学试剂厂。
1.2菌株与实验动物
实验所用的弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌由徐州师范大学生命科学学院微生物实验室分离鉴定，保存。
所用大肠杆菌菌株来自于禽类。
试验所用的斑马鱼为市场销售的蓝条纹斑马鱼，采用充分曝气的清水饲养,并在水循环和增氧条件下生活1周以适应环境。
1.3斑马鱼浸泡试验
1.3.1平板计数
将弗氏柠檬酸杆菌，大肠杆菌接种于LB液体培养基37℃振荡培养24小时，吸光度在之间，4000转/min离心10min,收集菌体，PBS洗1次，再离心一次，在原液浓度基础上稀释10-1—10-88个梯度，取最低浓度的菌液涂基本培养基平板，在37℃的培养箱中培养24h，计算平板上长出的菌落数即cfu；计算出菌液浓度。
1.3.2OD值的测定
用分光光度计在600nm波长下测定菌液的吸光度，即OD值。
每种菌共测定三个稀释倍数，即稀释2倍，稀释4倍，稀释10倍。
1.3.3斑马鱼创伤处理
用刀片在斑马鱼脊椎上轻轻划一伤口，制造创伤，可增加浸泡时的感染几率。
1.3.4浸泡斑马鱼
斑马鱼浸泡实验分为饲养温度25℃、28℃两组，对照组则浸泡等量0.65%氯化钠溶液。
用菌浓度108—1010cfu弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌细菌进行感染试验，每组3条，浸泡时间为10min或15min，各组分开饲养，定时观察斑马鱼的发病和死亡情况，连续观察5-7d，记录每条鱼的死亡时间，计算致死率和半致死时间（LT50）。
重复两次实验，取两次实验结果的平均值，以减少实验误差。
1.4细菌分离与鉴定
将死亡斑马鱼在70%L酒精中浸泡1min后,无菌条件下剖开腹部,用接种环沾取腹腔液接种至基本培养基平板。
在培养箱中37℃培养过夜后,用长出的菌落与相对应的菌落进行比较分析。
2结果与分析
2.1平板计数
将原大肠杆菌菌液稀释8个浓度梯度后涂平板，经37℃培养24h后，计数平板上的菌落数，取平均值后为4，即原菌液浓度为4×109cfu/ml，
同样弗氏柠檬酸杆菌：
平均值10,即原菌液浓度为10×109cfu/ml。
2.2菌液OD值
表1大肠杆菌在的OD值
Table1thebacteriaconcentrationOD
浓度
2.0×109
1.0×109
2.0×108
OD值
1.229
0.698
0.265
大肠杆菌菌液的OD值随浓度的降低而减小，浓度为2.0×109（稀释2倍），OD值为1.229,浓度为2.0×109（稀释4倍），OD值为0.698,浓度为2.0×108（稀释10倍），OD为0.265
表2弗氏柠檬酸杆菌的OD值
Table2thebacteriaconcentrationOD
项目
5.0×109
2.5×109
1.0×109
OD值
1.319
0.788
0.355
弗氏柠檬酸杆菌菌液的OD值随浓度的降低而减小，浓度为5.0×109（稀释2倍），OD值为1.319,浓度为2.5×109（稀释4倍），OD值为0.788,浓度为1.0×109（稀释10倍），OD为0.355。
2.3致死情况
表3饲养温度为25℃时，大肠杆菌对斑马鱼的致死率和时间
Table2Rearingtemperatureof25℃,themortalityrateandtimeofimmersioninzebrafishforE.coli
浓度
致死率
4.0×108（cfu/ml）
4.0×109（cfu/ml）
1.6×1010（cfu/ml）
10min
66.7%（2/3）
66.7%（2/3）
100%（3/3）
LT50
49h
20h
7min
大肠杆菌在25℃时，浓度为4.0×108（cfu/ml）时，致死率为66.7%，半致死时间为49h，浓度为4.0×109（cfu/ml）时，致死率为66.7%，半致死时间为20h，浓度为1.6×1010（cfu/ml）时，致死率为100%，半致死时间为7min。
表4饲养温度为28℃时，大肠杆菌对斑马鱼的致死率和时间
Table3Rearingtemperatureof28℃,themortalityrateandtimeofimmersioninzebrafishforE.coli
浓度
致死率
1.6×109（cfu/ml）
8.0×109（cfu/ml）
10min
66.7%（2/3）
33.3（1/3）
15min
66.7%（2/3）
66.7（2/3）
LT50
15h
9h
大肠杆菌在28℃时，浸泡15min，浓度为1.6×109（cfu/ml）时，致死率为66.7%，半致死时间为15h，浓度为8.0×109（cfu/ml）时，致死率为66.7%，半致死时间为9h。
表5弗氏柠檬酸杆菌的对斑马鱼的致死率和时间
Table5Rearingtemperature,themortalityrateandtimeofimmersioninzebrafishforcitrobacterfreundii
浓度、温度
15min
4.0×1010（cfu/ml）
25℃
2.0×1010（cfu/ml）
28℃
致死率
66.7（2/3）
66.7（2/3）
LT50
27h
20h
弗氏柠檬酸杆菌在25℃时，浓度为1.0×1010（cfu/ml）时,致死率为66.7%，半致死时间为27h。
在28℃时，浓度为2.0×1010（cfu/ml）时，致死率为66.7%，半致死时间为20h。
大肠杆菌：
当饲养温度为25℃时，浸泡时间为10min,菌液浓度为4×108cfu时，96h内致死率为66.7%，半致死时间49h；当浓度为4×109cfu时，96h内致死率为66.7%，半致死时间20h；浓度为1.6×1010cfu，10min致死率100%，半致死时间为7min。
在同一温度下，随着浓度的增大，半致死时间缩短；浓度为4×108cfu，4×109cfu时，致死率都为66.7%，但当浓度增大到1.6×1010cfu时，在浸泡的10min内，致死率为100%，致死率增大（见表3,4）。
而当饲养温度上升为28℃时，浸泡时间为15min，菌液浓度为4×109cfu，浸泡10min，96h内致死率为66.7%，，半致死时间为15h；浓度为8×109cfu，96h内致死率100%,半致死时间为9h。
在28℃下，浓度越高，致死率越高，半致死时间也缩短（见表3,4）。
弗氏柠檬酸杆菌：
当饲养温度为25℃时，浸泡时间为15min,菌液浓度为4.0×1010cfu时，96h致死率为66.7%，半致死时间27h；当饲养温度为28℃时,浓度为2.0×1010cfu，96h致死率66.7%，半致死时间20h。
25℃时菌液浓度为28摄氏度时菌液浓度的2倍，但28℃时的半致死时间却短于25℃时的。
（见表5）。
综上所述，菌浓度越高，斑马鱼越易被感染，菌浓度为8×109cfu，是研究大肠杆菌感染斑马鱼免疫的最佳浓度，菌浓度为2.0×1010cfu是研究感染弗氏柠檬酸杆菌对斑马鱼免疫的最佳浓度，且斑马鱼感染后在28℃饲养比在25℃现象更明显。
2.4斑马鱼的临床及病理变化
感染后死亡的斑马鱼伤口发红，腮部泛红，腹部膨胀，剖检观察到，肝脏呈现苍白色，腹腔内有较多积水，而空白对照组并无以上现象。
3.讨论
本实验中所使用的大肠杆菌来自于健康禽类，当饲养温度为25℃时，浸泡时间为10min,菌液浓度为4×108cfu时，致死率为66.7%（2/3），半致死时间49h，浓度为4×109cfu，致死率为66.7%（2/3），半致死时间20h,浓度为1.6×1010cfu，致死率100%（3/3），半致死时间为7min。
当饲养温度为28℃时，菌液浓度为8×109cfu，浸泡10min，致死率为66.7%（2/3），，半致死时间15h，浓度为4×109cfu，浸泡15min,致死率100%（3/3），半致死时间为9h。
同一温度下，菌液的浓度越高，半致死时间越短，致死率总体也是提高的。
不同温度，同一浓度下，28℃的半致死时间短于25℃时的。
但对于25℃时，浓度为1.6×1010cfu，在浸泡的10min内，实验鱼全部死亡，半致死时间为7min，这种情况与菌液浓度过高有关，由于浓度过高，鱼浸泡在其中，缺少氧气，最终死亡，这与本实验中感染死亡不同，此种情况斑马鱼不是由于斑马鱼被细菌感染而造成的死亡。
本实验中所使用的弗氏柠檬酸杆菌来自于鱼类，浸泡15min，在25℃时，浓度为4.0×1010cfu时，死亡率为66.7%，半致死时间为27h，当温度为28℃时，浓度为2.0×1010cfu，死亡率为66.7%，半致死时间为20h。
两种条件下的致死率虽然相同，但致死时间却不同，浓度为4.0×1010cfu的菌液半致死时间高于浓度为2.0×1010cfu的菌液，因此半致死时间不仅与浓度有关，还与温度有关，结合大肠杆菌的数据可以得出，28℃更利于菌在鱼体内的繁殖。
在攻毒方式上,Pre
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