《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程.docx
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《细胞实验》13流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡
AnnexinV检测细胞凋亡........................................................................................2
实验原理................................................................................................................2
实验用品................................................................................................................2
操作步骤................................................................................................................3
AnnexinVBlocking..............................................................................................5
凋亡细胞的DNA断裂片段分析.............................................................................7
实验原理................................................................................................................7
实验用品................................................................................................................8
操作步骤................................................................................................................9
BrdUFlowKits检测细胞增殖..............................................................................12
实验原理..............................................................................................................12
BrdUFlowKits试剂盒.......................................................................................12
结果分析..............................................................................................................17
流式仪器设置指南..............................................................................................18
线粒体膜电位变化检测细胞凋亡..........................................................................22
实验原理..............................................................................................................22
实验用品..............................................................................................................22
样本制备..............................................................................................................23
结果分析..............................................................................................................24
注意事项..............................................................................................................24
ActiveCaspase-3检测细胞凋亡...........................................................................26
实验原理..............................................................................................................26
实验步骤..............................................................................................................27
结果分析..............................................................................................................28
1
AnnexinV检测细胞凋亡
实验原理
AnnexinV是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合
蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发
生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸（PS）
由质膜内侧翻向外侧。
AnnexinV与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因
而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰
丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，
使用AnnexinV可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发
生磷脂酰丝氨酸外翻，所以AnnexinV常与鉴定细胞死活的核酸染料
（如PI或7-AAD）合并使用，来区分凋亡细胞（AnnexinV+/核酸染料-）
与死亡细胞（AnnexinV+/核酸染料+）。
实验用品
1.一次性12×75mmFalcon试管。
2.PBS缓冲液：
含0.1%NaN，过滤后2-8°C保存。
3
3.微量加样器和加样头。
2
4.AnnexinVBindingBuffer缓冲液（Cat.No.66121E）：
浓度为
10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
5.AnnexinV试剂与核酸染料：
AnnexinV
核酸染料
AnnexinV-Biotin（Cat.No.65872X）
Streptavidin-FITC（Cat.No.13024D）
AnnexinV-FITC（Cat.No.65874X）
AnnexinV-PE（Cat.No.65875X）
PI（Cat.No.66211E）或
7-AAD（Cat.No.34321X）
PI（Cat.No.66211E）
7-AAD（Cat.No.34321X）
6.FACS流式细胞仪：
上样检测。
7.CELLQuest软件：
获取和分析试验数据。
8.AnnexinV检测对照管：
AnnexinV
Biotin
A-阴性对照
SAv-FITC
B-补偿
1
C-补偿2
PI和
AnnexinV-Biotin
和SAv-FITC
SAv-FITC
7-AAD
PE
AnnexinV-PE
未染色细胞
未染色细胞
FITC
AnnexinV-FITC
PI
操作步骤
1.取Falcon试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1×BindingBuffer缓冲液制成1×106
细胞/ml的悬液。
3.Falcon试管中加入100µl细胞悬液。
4.按以下体积加入AnnexinV与核酸染料：
管号
名称
阴性对照
单阳1
单阳2
样本
荧光标记AnnexinV
核酸染料：
1
2
3
4
-
-
AV-FITC
-
-
PI
PI
AV-FITC
5.轻轻混匀，室温（20°C~25°C）避光处放置15分钟。
3
6.*使用AnnexinV-Biotin试剂进行检测时：
1×BindingBuffer缓冲液洗细胞一次，去上清。
1×BindingBuffer缓冲液100µl溶解SAv-FITC试剂0.5µg，加入到细胞管中。
轻轻混匀。
加入5µlPI，室温（20-25°C）避光处放置15分钟。
7.各试验管中分别加入1×BindingBuffer缓冲液400µl。
8.1小时内上流式细胞仪测定结果。
结果分析：
以下4个样本分别是阴性对照、AnnexinV单阳管、PI单阳管和试验管。
1.001
1.002
100
101
102
Annexin
103
104
100
101
102
FL1-Height
103
104
1.003
1.004
100
101
102
Annexin
103
104
100
101
102
FL1-Height
103
104
4
AnnexinVBlocking
待测细胞与未标记的重组AnnexinV预孵育，然后进行实验，是AnnexinV
细胞凋亡检测的质量控制。
原理是预先阻断AnnexinV-FITC的结合位点，这样
可以证明AnnexinV-FITC凋亡分析的特异性。
1.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1×BindingBuffer缓冲液制成1×106
细胞/ml的悬液。
2.在5ml的培养管中加入100µl细胞悬液（约1×10个细胞）。
3.加入5-15µg纯化的重组AnnexinV。
注意，不同的细胞系，以及凋亡的不同
阶段，其AnnexinV位点饱和所需要的纯化的重组AnnexinV含量不同。
某些
情况下，为达到最好效果，可以减少细胞数量，0.5×10个细胞加5-15µg纯
化的重组AnnexinV。
5
5
4.轻轻混匀，室温反应15分钟。
5.加入5µl的AnnexinV-FITC或/和PI，轻轻混匀，室温避光处放置15分钟。
6.各试验管中分别加入1×BindingBuffer缓冲液400µl。
7.1小时内上流式细胞仪测定结果。
8.结果分析：
下图A、B为Anti-Fas抗体诱导3小时后的JurkatT细胞,图C、D为
未处理的细胞；图A、C为AnnexinV-FITC染色的凋亡检测结果，图B、D
为AnnexinVBlocking后的检测结果。
5
PharMingen推荐AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒
规格
货号
AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKitI:
PartA：
AnnexinV-FITC（100tests）
PI（2ml）
100tests
6693KK
1×BindingBuffer缓冲液（50ml）
AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKitII（AnnexinV
Blocking）:
100tests
6710KK
PartA：
AnnexinV-FITC（100tests）
PI（2ml）
1×BindingBuffer缓冲液（50ml）
PartB：
PurifiedRecombinantAnnexinV（100µg）
6
凋亡细胞的DNA断裂片段分析
实验原理
在细胞发生凋亡后，最早出现胞膜外翻等现象，之后发生的程序性改变之一，
就是细胞核酸内切酶激活，出现DNA断裂片段。
核酸酶将染色质的高级结构断
裂为50-300kb的片段，最终断裂为200bp大小的DNA碎片。
DNA碎片检测的
方法是外源性TdT酶催化反应，常指“end-labeling”或“TUNEL”（terminal
deoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabeling）。
现在可以使用APO-DIRECT
Kit，用流式细胞术来检测凋亡细胞由于DNA断裂，造成DNA链3’-OH增多的
情况。
在APO-DIRECT分析中，TdT酶催化DNA单链和双链3’-OH末端非模板
依赖性的dUTPFITC掺入反应。
由于采用了直接荧光标记的FITC-dUTP，所以
一步反应后，就可以在流式细胞仪上检测DNA碎片。
7
APO-DIRECTKit（Cat.No.6536KK）试剂盒：
PartA（4°C保存）
PI/RNaseASolution
ReactionBuffer
RinsingBuffer
WashBuffer
PartB（-20°C保存）
FITC-dUTP
TdTEnzyme
NegativeControlCells：
已固定细胞
PositiveControlCells：
已固定细胞
实验用品
1.一次性12×75mmFalcon试管
2.蒸馏水
3.PBS缓冲液：
含0.1%NaN，过滤后2-8°C保存
3
4.固定液：
含1%多聚甲醛的PBS缓冲液
5.70%乙醇
6.冰浴箱
7.微量加样器和加样头
8.APO-DIRECTKit试剂盒
9.流式上机检测
8
操作步骤
1.细胞固定：
6
（1）用PBS洗细胞后，将细胞重悬于1%多聚甲醛中，浓度为1-2×10/ml，冰浴
30-60分钟。
（2）300×g离心5分钟，弃上清。
6
（3）用5mlPBS洗细胞两次，重悬于70%乙醇中，浓度为1-2×10/ml，冰浴
30-60
分钟。
（70%乙醇细胞悬液在-20°C放置12-18小时后进行细胞凋亡检测，
得到的效果最好。
细胞可以在-20°C保存几个月。
）
2.配制染色液，现用现配。
DNA标记液
ReactionBuffer
TdTEnzyme
FITC-dUTP
蒸馏水
1个测试
10.00μl
0.75μl
6个测试
60.00μl
4.50μl
12个测试
120.00μl
9.00μl
8.00μl
48.00μl
192.00μl
305.50μl
96.00μl
32.00μl
50.75μl
384.00μl
609.00μl
总体积
3．细胞染色：
（1）取离心管和Falcon试管，按标本顺序编号。
9
（2）取1×106细胞悬液加入离心管中，300×g
离心5分钟，弃去乙醇，留下沉积细
胞。
质控细胞（NegativeControlCells、PositiveControlCells）：
混匀后取1ml
（细胞数约1×10）加入离心管中，
6
/ml
300×g
离心5分钟，弃去乙醇，留下
沉积细胞。
（3）每管各加入1.0mlWashBuffer，洗细胞两遍，弃上清。
（4）加入染色液50μl，混匀。
（5）37°C温育60分钟（或者室温过夜），每15分钟摇匀一次。
（非质控细胞
37°C温育时间需根据不同情况有所凋整。
）
（6）各管加入1.0mlRinseBuffer，300×g离心5分钟，弃上清。
重复两遍，弃去
上清。
（7）加入0.5mlPI/RNaseASolution，混匀。
若细胞浓度低，可将用量调整到
0.3ml。
（8）室温避光处反应30分钟。
（9）3小时内上流式细胞仪测定结果。
4.结果分析：
PI测定细胞DNA含量，FITC-BrdU测定调亡。
做DNA-W/DNA-A点图和DNA-A/FITC-BrdU点图，进行数据获取。
取单个细
胞门（DNA-W/DNA-A设门），分析BrdU直方图，获得细胞凋亡信息。
同时，可
分析细胞周期（DNA-A）与细胞凋亡（BrdU）的关系。
10
5.阴性质控细胞NegativeControlCells和阳性质控细胞PositiveControlCells：
11
BrdUFlowKits检测细胞增殖
实验原理
BrdU中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸
腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu
单克隆抗体，荧光染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物，可判
断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
BrdUFlow
Kits是用BrdU染色和流式分析结合高效的试剂盒，包括在BrdU存在下培
养细胞，以适宜浓度的DNA酶使胞内DNA变性，加强掺入BrdU与抗体
的亲和力，同时保留胞内蛋白结构和荧光素荧光强度，从而避免了DNA变
性条件与胞内及表面标志同时检测条件的冲突，运用荧光标记的抗细胞表
面抗原单抗及抗细胞因子单抗,结合固定、破膜、通透等处理技术使同时检
测细胞活化、增殖、DNA合成及胞内细胞因子的分泌成为可能。
7-AAD染
色总DNA，通过BrdU和7-AAD双色染色就能刻画中细胞在整个细胞周期中
增殖时期的特点。
BrdUFlowKits试剂盒
FITCBrdUFlowKit
Cat.No.559619（50tests）
APCBrdUFlowKit
Cat.No.552598（50tests）
Cat.No.557891（4×50tests）
Cat.No.557892（4×50tests）
1.抗BrdU荧光抗体
6
每管50μl染色50样本（10cells/样本）.FITCBrdUFlowKit（Cat.
No.559619）包含50μlFITCanti-BrdU抗体。
APCBrdUFlowKit（Cat.No.
12
552598）,包含50μlAPCanti-BrdU抗体。
抗体使用前用BDPerm/Wash
Buffer按照1:
50稀释。
每个样本加入50μl稀释抗体。
2.BDCytofix/Cytoperm™Buffer
一步法固定透膜试剂用于进行细胞内染色。
此试剂维持细胞形态，固
定细胞蛋白，为下一步胞内染色进行透膜。
3.BDPerm/WashBuffer
10×浓缩液，使用时用去离子水按照1：
10稀释。
Perm/WashBuffer（1
×）只能用于固定好的细胞，在未固定的细胞使用该试剂会造成细胞的损
伤。
4.BDCytoperm™PlusBuffer
BDCytopermPlusBuffer作为染色增强和二次破膜试剂（100μ
l/sample）。
只能用于固定好的细胞。
BrdU
每个瓶含有0.5ml的10mg/mlBrdU，稀释于1×DPBS中的（32.5mM）溶
液。
无菌制备所提供的BrdU溶液，（0.22μm过滤）其不含有防腐剂；因此
推荐在无菌条件下处理该溶液。
该母液可以通过腹膜内（i.p.）注射于动物
或者稀释到1mM溶液用于体外标记。
对于通过i.p.注射的体内标记，参见手
册的体内标记部分（第11页）。
为了在体外标记细胞，首先通过将31μl
加入到1ml的1×DPBS或者培养基中（这是32×稀释）将母液（10mg/mlBrdU
溶液）稀释到1mM溶液。
将10μl的1mM溶液加入到每ml培养基中以获得的
10μM最终浓度。
BrdU的分子量为307.1。
提供5瓶BrdU溶液，并且储存在
–80°C。
注意：
已经证实BrdU溶液在4˚C下可以稳定长达4个月或者可以再冷冻。
避免多次冰冻循环。
5.DNase
.每个瓶中含有300μl的DNase在1×DPBS中的1mg/ml溶液。
当着色
10个或更多样品时，解冻整瓶DNase溶液，加入700μl的1×DPBS以制备
300μg/ml的工作母液。
注意：
如果使用DNase处理少于10个样品，取30μl等份的（1mg/ml）
DNase溶液/样品，并在–80°C下再冷冻剩余的1mg/mlDNase。
13
注意：
DNase母液（即，1mgDNase/ml）在失活前可以再冷冻一次。
6
使用总计100μl的工作母液处理每个细胞样品（即，30μgDNase/10细
胞），在37°C下进行培育。
提供5瓶DNase，并且储存在–80°C。
6.7-AAD.
每个样本用20μl7-AAD染色（106cells/样本）。
7.StainingBuffer（未提供）
1×DPBS+3%灭活的胎牛血清FBS+0.09%叠氮化钠.
Note:
BDPharmingen™StainBuffer（FBS）（Cat.No.
554656）
实验步骤
14
一.BrdU体外标记培养的细胞和细胞系
体外标记细胞，每毫升组织培养液中小心加入10μlBrdUsolution（1mMBrdUin
1×DPBS）这步重要的是避免各种方面对细胞的干扰（例如离心步骤或温度变化）。
这
些都可能干扰细胞正常周期。
.细胞培养的密度不要超过2×106cells/ml。
孵育足够的
时间。
脉冲标记实验中时间点和脉冲时间长度的选择依赖于实验细胞群的细胞周期开始
和进展的速度。
例如对于活跃增殖细胞系
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