《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程.docx

1、细胞实验13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 流式检测细胞凋亡Annexin V 检测细胞凋亡 .2实验原理.2实验用品.2操作步骤.3Annexin V Blocking .5凋亡细胞的 DNA 断裂片段分析 .7实验原理.7实验用品.8操作步骤.9BrdU Flow Kits 检测细胞增殖.12实验原理.12BrdU Flow Kits 试剂盒.12结果分析.17流式仪器设置指南.18线粒体膜电位变化检测细胞凋亡.22实验原理.22实验用品.22样本制备.23结果分析.24注意事项.24Active Caspase-3 检测细胞凋亡 .26实验原理.26实验步骤.27结果分析.281 An

2、nexin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与 DNA 碎片检测比较，使用 Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以 Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如 PI 或 7-AAD)合并使

3、用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。实验用品1. 一次性1275mm Falcon试管。2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8C保存。33. 微量加样器和加样头。2 4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10，使用时，用稀释为1浓度的应用液。5. Annexin V试剂与核酸染料：Annexin V核酸染料Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D）Annexin

4、 V-FITC（Cat. No. 65874X）Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X）PI（Cat. No. 66211E）7-AAD（Cat. No. 34321X）6. FACS流式细胞仪：上样检测。7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。8. Annexin V检测对照管：Annexin VBiotinA-阴性对照SAv-FITCB-补偿1C-补偿 2PI 和Annexin V-Biotin和 SAv-FITCSAv-FITC7-AADPEAnnexin V-PE未染色细胞未

5、染色细胞FITCAnnexin V-FITCPI操作步骤1. 取 Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。2. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1 Binding Buffer缓冲液制成1106细胞/ml的悬液。3. Falcon试管中加入100 l细胞悬液。4. 按以下体积加入Annexin V与核酸染料：管号名称阴性对照单阳 1单阳 2样本荧光标记 Annexin V核酸染料：1234-AV-FITC-PIPIAV-FITC5. 轻轻混匀，室温（20C 25C）避光处放置15分钟。3 6. *使用Annexin V-Biotin试剂进行检测时： 1Binding Buf

6、fer缓冲液洗细胞一次，去上清。 1Binding Buffer缓冲液100l溶解SAv-FITC试剂0.5g，加入到细胞管中。 轻轻混匀。 加入5l PI，室温（20-25C）避光处放置15分钟。7. 各试验管中分别加入1Binding Buffer缓冲液400l。8. 1小时内上流式细胞仪测定结果。结果分析：以下 4 个样本分别是阴性对照、Annexin V 单阳管、PI 单阳管和试验管。1.0011.002100101102Annexin103104100101102FL1-Height1031041.0031.004100101102Annexin103104100101102FL1-

7、Height1031044 Annexin V Blocking待测细胞与未标记的重组 Annexin V 预孵育，然后进行实验，是 Annexin V细胞凋亡检测的质量控制。原理是预先阻断 Annexin V-FITC 的结合位点，这样可以证明 Annexin V-FITC 凋亡分析的特异性。1. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1Binding Buffer缓冲液制成1106细胞/ml的悬液。2. 在5ml的培养管中加入100l细胞悬液（约110 个细胞）。3. 加入5-15g纯化的重组Annexin V。注意，不同的细胞系，以及凋亡的不同阶段，其Annexin V位点饱和所需要的纯化

8、的重组Annexin V含量不同。某些情况下，为达到最好效果，可以减少细胞数量，0.510 个细胞加5-15g纯化的重组Annexin V。554. 轻轻混匀，室温反应15分钟。5. 加入5l的Annexin V-FITC或/和PI，轻轻混匀，室温避光处放置15分钟。6. 各试验管中分别加入1Binding Buffer缓冲液400l。7. 1小时内上流式细胞仪测定结果。8. 结果分析：下图 A、B 为 Anti-Fas 抗体诱导 3 小时后的 Jurkat T 细胞, 图 C、D 为未处理的细胞；图 A、C 为 Annexin V-FITC 染色的凋亡检测结果，图 B、D为 Annexin

9、V Blocking 后的检测结果。5 PharMingen 推荐 Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒规格货号Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I:Part A：Annexin V-FITC(100 tests)PI (2ml)100tests6693KK1Binding Buffer 缓冲液(50ml)Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II (Annexin VBlocking):100tests6710KKPart A：Annexin V-FITC(100 tests)PI (2ml)1Bindin

10、g Buffer 缓冲液(50ml)Part B：Purified Recombinant Annexin V(100g)6 凋亡细胞的 DNA 断裂片段分析实验原理在细胞发生凋亡后，最早出现胞膜外翻等现象，之后发生的程序性改变之一，就是细胞核酸内切酶激活，出现 DNA 断裂片段。核酸酶将染色质的高级结构断裂为 50-300kb 的片段，最终断裂为 200bp 大小的 DNA 碎片。DNA 碎片检测的方法是外源性 TdT 酶催化反应，常指“end-labeling”或“TUNEL” (terminaldeoxynucleotidyltransferase dUTP nick end label

11、ing)。现在可以使用 APO-DIRECTKit，用流式细胞术来检测凋亡细胞由于 DNA 断裂，造成 DNA 链 3-OH 增多的情况。在 APO- DIRECT 分析中，TdT 酶催化 DNA 单链和双链 3-OH 末端非模板依赖性的 dUTP FITC 掺入反应。由于采用了直接荧光标记的 FITC-dUTP，所以一步反应后，就可以在流式细胞仪上检测 DNA 碎片。7 APO-DIRECT Kit（Cat. No. 6536KK）试剂盒：Part A（4C 保存）PI/RNase A SolutionReaction BufferRinsing BufferWash BufferPart

12、B（-20C 保存）FITC-dUTPTdT EnzymeNegative Control Cells：已固定细胞Positive Control Cells：已固定细胞实验用品1. 一次性 1275mm Falcon 试管2. 蒸馏水3. PBS 缓冲液：含 0.1%NaN ，过滤后 2-8C 保存34. 固定液：含 1%多聚甲醛的 PBS 缓冲液5. 70%乙醇6. 冰浴箱7. 微量加样器和加样头8. APO-DIRECT Kit 试剂盒9. 流式上机检测8 操作步骤1. 细胞固定：6（1） 用PBS 洗细胞后，将细胞重悬于1%多聚甲醛中，浓度为1-210 /ml，冰浴30-60 分钟。（

13、2） 300g 离心5 分钟，弃上清。6（3） 用5ml PBS 洗细胞两次，重悬于70%乙醇中，浓度为1-210 /ml，冰浴30-60分钟。（70%乙醇细胞悬液在-20C 放置 12-18 小时后进行细胞凋亡检测，得到的效果最好。细胞可以在-20C 保存几个月。）2. 配制染色液，现用现配。DNA 标记液Reaction BufferTdT EnzymeFITC-dUTP蒸馏水1 个测试10.00l0.75l6 个测试60.00l4.50l12 个测试120.00l9.00l8.00l48.00l192.00l305.50l96.00l32.00l50.75l384.00l609.00l总

14、体积3 细胞染色：（1）取离心管和Falcon 试管，按标本顺序编号。9 （2）取1106 细胞悬液加入离心管中，300g离心5 分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。质控细胞（Negative Control Cells、Positive Control Cells）：混匀后取1ml（细胞数约110 ）加入离心管中，6/ml300g离心5 分钟，弃去乙醇，留下沉积细胞。（3） 每管各加入1.0ml Wash Buffer，洗细胞两遍，弃上清。（4） 加入染色液50l，混匀。（5） 37C 温育60 分钟（或者室温过夜），每15 分钟摇匀一次。（非质控细胞37C 温育时间需根据不同情况有所凋整。）（6

15、） 各管加入1.0ml Rinse Buffer，300g 离心5 分钟，弃上清。重复两遍，弃去上清。（7） 加入 0.5ml PI/RNase A Solution，混匀。若细胞浓度低，可将用量调整到0.3ml。（8） 室温避光处反应30 分钟。（9） 3 小时内上流式细胞仪测定结果。4. 结果分析：PI 测定细胞DNA 含量，FITC-BrdU 测定调亡。做DNA-W/DNA-A 点图和DNA-A/FITC-BrdU 点图，进行数据获取。取单个细胞门（DNA-W/DNA-A 设门），分析BrdU 直方图，获得细胞凋亡信息。同时，可分析细胞周期（DNA-A）与细胞凋亡（BrdU）的关系。10

16、 5. 阴性质控细胞 Negative Control Cells 和阳性质控细胞 Positive Control Cells：11 BrdU Flow Kits 检测细胞增殖实验原理BrdU中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，荧光染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。BrdU FlowKits是用 BrdU染色和流式分析结合高效的试剂盒，包括在BrdU 存在下培养细胞，以适宜浓度的DNA 酶使胞内DNA 变性，加强掺入B

17、rdU 与抗体的亲和力，同时保留胞内蛋白结构和荧光素荧光强度，从而避免了DNA 变性条件与胞内及表面标志同时检测条件的冲突，运用荧光标记的抗细胞表面抗原单抗及抗细胞因子单抗,结合固定、破膜、通透等处理技术使同时检测细胞活化、增殖、DNA 合成及胞内细胞因子的分泌成为可能。7-AAD染色总DNA，通过BrdU和7-AAD双色染色就能刻画中细胞在整个细胞周期中增殖时期的特点。BrdU Flow Kits 试剂盒FITC BrdU Flow KitCat. No. 559619 (50 tests)APC BrdU Flow KitCat. No. 552598 (50 tests)Cat. No.

18、 557891 (450 tests)Cat. No. 557892 (450 tests)1. 抗BrdU荧光抗体6每管50l 染色50 样本(10 cells/样本). FITC BrdU Flow Kit(Cat.No. 559619) 包含50l FITC anti-BrdU抗体。APC BrdU Flow Kit (Cat. No.12 552598), 包含50 l APC anti-BrdU抗体。抗体使用前用 BD Perm/WashBuffer按照1:50稀释。每个样本加入50 l 稀释抗体。2. BD Cytofix/Cytoperm Buffer一步法固定透膜试剂用于进行细

19、胞内染色。此试剂维持细胞形态，固定细胞蛋白，为下一步胞内染色进行透膜。3. BD Perm/Wash Buffer10浓缩液，使用时用去离子水按照1：10稀释。Perm/Wash Buffer (1)只能用于固定好的细胞，在未固定的细胞使用该试剂会造成细胞的损伤。4. BD Cytoperm Plus BufferBD Cytoperm Plus Buffer 作为染色增强和二次破膜试剂(100 l/sample)。只能用于固定好的细胞。BrdU每个瓶含有0.5ml的10 mg/ml BrdU，稀释于1DPBS中的(32.5 mM)溶液。无菌制备所提供的BrdU溶液，(0.22 m 过滤)其不

20、含有防腐剂；因此推荐在无菌条件下处理该溶液。该母液可以通过腹膜内（i.p.）注射于动物或者稀释到1 mM溶液用于体外标记。对于通过i.p.注射的体内标记，参见手册的体内标记部分（第11页）。为了在体外标记细胞，首先通过将31 l加入到1ml的1DPBS或者培养基中（这是32稀释）将母液(10 mg/ml BrdU溶液)稀释到1mM溶液。将10 l的1 mM溶液加入到每ml培养基中以获得的10 M最终浓度。BrdU的分子量为307.1。提供5瓶BrdU溶液，并且储存在80C。注意：已经证实BrdU溶液在4C下可以稳定长达4个月或者可以再冷冻。避免多次冰冻循环。5. DNase. 每个瓶中含有30

21、0 l的DNase在1DPBS中的1 mg/ml溶液。当着色10个或更多样品时，解冻整瓶DNase溶液，加入700 l的1DPBS以制备300 g/ml的工作母液。注意：如果使用DNase处理少于10个样品，取30 l等份的(1 mg/ml)DNase溶液/样品，并在80C下再冷冻剩余的1 mg/ml DNase。13 注意：DNase母液（即，1 mg DNase/ml）在失活前可以再冷冻一次。6使用总计100 l的工作母液处理每个细胞样品（即，30 g DNase/ 10 细胞），在37C下进行培育。提供5瓶DNase，并且储存在80C。6. 7-AAD.每个样本用20 l 7-AAD染色

22、 (106 cells/样本)。7. Staining Buffer（未提供）1DPBS + 3% 灭活的胎牛血清FBS + 0.09%叠氮化钠.Note: BD Pharmingen Stain Buffer (FBS) (Cat. No.554656)实验步骤14 一. BrdU体外标记培养的细胞和细胞系体外标记细胞，每毫升组织培养液中小心加入10 l BrdU solution (1 mM BrdU in1DPBS)这步重要的是避免各种方面对细胞的干扰（例如离心步骤或温度变化）。这些都可能干扰细胞正常周期。. 细胞培养的密度不要超过2106 cells/ml 。 孵育足够的时间。脉冲标记实验中时间点和脉冲时间长度的选择依赖于实验细胞群的细胞周期开始和进展的速度。例如对于活跃增殖细胞系