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毕业设计0614终稿

2012届毕业设计（论文）

课题题目：

杜仲叶饲料添加剂的研究

学院：

食品与轻工学院

专业：

食品科学与工程

学号：

1304080102

姓名：

黄博

指导教师：

熊强（副教授）

起讫日期：

2012.3—2012.6

2012年6月

杜仲叶饲料添加剂的研究

摘要

杜仲在我国分布范围极广。

由于杜仲具有调节血压血糖、增强免疫功能等药理保健作用，近些年来，作为饲料添加剂的研究颇为热门。

本实验通过夏叶与秋叶成分的分析对比，确定选用秋季采收的杜仲叶作为发酵样品，分别采用两种枯草芽孢杆菌以及两种酵母菌对杜仲叶进行发酵，并对发酵后杜仲叶中绿原酸、多糖、蛋白质等成分的提取及测定。

实验表明，经不同菌种对杜仲叶进行发酵后，杜仲叶中绿原酸含量有所下降，但是蛋白质含量大大提高，并且纤维素得到了有效降解，更易于动物吸收。

其中枯草芽孢杆菌1为本实验筛选出的适宜杜仲叶的发酵的微生物。

关键词：

杜仲饲料添加剂发酵枯草芽孢杆菌酵母菌

ABSTRACT

Thedistributionofeucommiaulmoidesinourcountryisveryextensive.Eucommiahassuchfunctionsasadjustingbloodpressureandbloodsugar,enhancingimmunefunctionandpharmacologicalhealthcarefunction,sothatinrecentyears,EucommiaulmodiesOlivleavesasfeedadditiveshaveraisedgreatattentionofthescientists

Thisexperimentusetwokindsofbacillussubtilisandtwosaccharomycetesofeucommlaulmoidestoprocessthefermentationofeucommiaulmoidesolivleaves.afterthefermentationweneedtodotheExtractionanddeterminationofchlorogenicacid,polysaccharides,proteincomponent.Theexperimentindicatedthat,afterdifferentstrainsofmicroorganismfermentatingtheeucommiaulmoidesleaves,thecontentofchlorogenicacidineucommiaulmoidesolivleaveshaddeclined,butthecontentofproteingreatlyimproved.what,smorecellulosehadaeffectivedegradation,easierforanimalabsorption.bacillussubtilis1intheexperimentwerethesuitablemicroorganismsforthefermentationofeucommiaulmoidesolivleaves..

KeyWords：

EucommiaulmoidesOliv;Feedadditive;Ferment;Bacillussubtilis;Saccharomycetes

目录

摘要I

ABSTRACTII

第一章文献综述1

1.1杜仲叶概述1

1.1.1杜仲叶的主要成分1

1.1.2杜仲叶的主要生理作用1

1.2杜仲叶饲料添加剂2

1.2.1杜仲叶饲料添加剂的功能及特点3

1.2.2杜仲叶饲料添加剂的加工3

1.2.3杜仲叶饲料添加剂研究现状4

1.3本研究的目的和意义4

第二章实验部分5

2.1实验材料5

2.1.1菌种来源5

2.1.2杜仲叶样品来源：

5

2.1.3主要试剂5

2.1.4主要仪器6

2.2实验流程6

2.3发酵方法6

2.3.1培养基6

2.3.2菌种的扩大培养6

2.4检测方法7

2.4.1绿原酸含量测定7

2.4.2多糖含量测定——蒽酮比色法[21]8

2.4.3蛋白质含量测定10

第三章结果与讨论11

3.1样品成分测定结果11

3.2发酵前后杜仲叶的成分变化11

3.2.1绿原酸含量的变化11

3.2.2蛋白质含量的变化11

3.2.3多糖（纤维素）含量的变化12

3.2.4其它成分含量的变化12

3.3结论与展望12

参考文献14

致谢16

第一章文献综述

1.1杜仲叶概述

杜仲系杜仲科杜仲属植物，是我国特有的木本植物和经济林树种，亦是重要的中药材。

杜仲为落叶乔木，高达20米，胸径50厘米。

树冠圆球形。

树皮深灰色，树枝具片状髓，树体各部折断均具银白色胶丝。

小枝光滑，无顶芽。

单叶互生，椭圆形，长7～14厘米，有锯齿，羽状脉，老叶表面网脉下限，无托叶。

其主要分布在陕西、甘肃、浙江、江西、河南、湖南、广西、广东、四川、贵州、云南等省区。

杜仲干燥皮入药，已有两千多年的历史，《神农本草经》将其列为上品，名为“思仙”[1]。

我国杜仲资源约300多万亩，夏叶、秋叶可采摘量和秋后老叶合计约100多万吨，但大部分被浪费掉了[2]。

中国占世界杜仲资源99%，全球总产量只满足需求1/9，市场潜力巨大。

因此，杜仲综合开发利用成为新的引人注目投资热点之一。

1.1.1杜仲叶的主要成分

杜仲富含氨基酸、维生素、矿物元素等多种常规成分，如矿物元素有镁、钙、钾、钠、铜、锰、锌、铁、磷等。

杜仲叶含蛋白质14.5%、纤维素11%，还有15种氨基酸，其中包括人体必需的6种氨基酸。

还含有钙、锌、铁、锰、铜、镁等20种矿物质微量元素，丰富的维生素E和β胡萝卜素、维生素B2及微量的维生素B1。

除此之外、杜仲还含有自身独有的天然有效生物活性功效成分，如绿原酸、杜仲苷、松脂素苷、桃叶珊瑚苷、多肽、熊果酸、鞣质及黄酮类物质等[3]。

有研究发现杜仲的叶与皮等部分所含药效成分基本相同，只是含量有区别，具有同等的药理效果，完全可以以叶代皮[4]。

其中主要药效成份绿原酸、桃叶珊瑚昔、氨基酸及微量元素在杜仲叶中的含量都比杜仲皮高。

1.1.2杜仲叶的主要生理作用

近年来，国内外许多学者对杜仲的化学成分和药理作用进行了大量研究，发现杜仲具有调节血压、降低血糖、调节血脂、抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长等药理作用，以及延缓衰老、美白养颜、滋阴补肾、强壮筋骨等功效。

正因为如此，近年来国内外掀起了一股研究、开发杜仲的热潮。

（1）抗氧化及抗衰老

用杜仲叶制作的保健品，其抗氧化效果比VE好得多，另外杜仲愈伤组织也有很好的抗氧化效果。

杜仲可促进人体皮肤、骨骼和肌肉中蛋白质胶原的合成和分解，促进人体新陈代谢，预防衰老[5]。

（2）免疫调节功能

杜仲叶能显著改善人体免疫系统的免疫力，防御疾病、抗病原体的侵入，并且还具有双向调节细胞免疫功能的作用，使人体的免疫功能处于良好状态。

（3）抗突变、抗癌

现代药理实验证明杜仲有抗癌和抑癌的作用，其有效成分与其所含有木脂素、苯丙素及环烯醚萜类化合物有关。

（4）降压作用

杜仲叶和皮一样具有降压作用，而巨叶较皮具有更佳的疗效。

现代药理学证明杜仲对血压具有双向调节（低血压者能升高血压，高血压者能降低血压）作用，降压效果尤为明显，而且疗效平稳，无毒副作用，这是任何化学降压药物都无法比拟的[6]。

（5）抗菌消炎功能

杜仲叶中含有丰富的绿原酸，其含量达2.5%～5.28%。

绿原酸具有广泛的抗菌、兴奋中枢神经、利胆、增进胆汁分泌、止血、提高自血球数量和抗病毒的作用。

桃叶珊瑚苷有抑菌、利尿作用，并能促进伤口愈合，另外桃叶珊瑚苷具有明显的保肝作用，它与葡萄糖苷酶一起培养后会产生明显的抗病毒作用，抑制乙型肝炎病毒DNA的复制，但其本身并不具有抗病毒功能。

（6）清除体内垃圾

杜仲叶能清除肝、心、血清中的超氧阴离子，对自由基的清除率达76.8%以上，对降低肝组织过氧化脂质的作用达64%。

（7）其他功效

日本近年来研究表明，使用以杜仲叶为原料提取的化妆品后，可使肌肤美白、消除老人斑，还能够增加头发的黑色素细胞，提高头发黑色素细胞的活性。

饮用杜仲茶还可消除肥胖、防止牙齿松动、预防牙周病及老年痴呆症，治疗畏寒症等。

1.2杜仲叶饲料添加剂

由于杜仲具有防治高血压、提神抗劳、增强免疫功能、抗肌肉骨骼老化、清除体内“垃圾”、防癌抗癌等药理保健作用，杜仲被广泛应用于保健品、化妆品等的开发项目中。

近些年来，杜仲叶作为饲料添加剂的研究颇为热门。

随着人们生活水平的提高，保健与回归自然的意识不断增强，人们渴望无污染、无残留的绿色畜禽产品，从而促使了畜禽饲料添加剂由化工型逐渐转为中草药型[7]。

20世纪90年代以来，随着人们对抗生素和某些化学合成药危害性认识的加深，以及对食品安全性要求的提高，人们越来越重视植物源药和植物源饲料添加剂的研究与应用。

现在世界各国均加大科研力度，正在积极寻找来源广泛、使用方便、成本低廉、应用范围广、效果显著、残留量低、不易产耐药性、配伍性强等特点的新型添加剂代替抗生素类添加剂[8]。

而对杜仲作为动物饲料添加剂的研究和产品开发也随之加强。

1.2.1杜仲叶饲料添加剂的功能及特点

杜仲叶经过处理后，可作为饲料添加剂添加到鸡、兔、牛、羊及鱼类的饲料，从而提高其产量和品质。

如将1%的杜仲粉添加到鸡饲料中，可使母鸡产蛋率提高28%以上，产蛋量提高52.4%，鸡蛋中胆固醇含量降低20%以上；将杜仲粉添加到鱼饲料中，可使鱼肉中的胶原蛋白增加1.6倍；将杜仲粉添加到螃蟹饲料中，可减少螃蟹病害的发生，并且其味道鲜美，口感近天然野生；添加到兔、牛、羊饲料中，可使动物脂肪含量减少，瘦肉增加[9]。

日本有学者以杜仲叶作为蛋鸡饲料添加剂，生产低胆固醇和高密度脂蛋白的鸡蛋；王纪亭等报道了杜仲叶作为饲料添加剂在肉鸡生产中的应用；杜仲叶提取物制剂对动物的镇痛作用及免疫功能影响的研究均有报道。

吕锦芳等报道了杜仲叶对肉杂鸡生产性能及部分肉品质的影响[10]。

因此，杜仲叶饲料添加剂具有以下产品特点[11]：

天然植物提取物，不含任何化学合成类物质；有效成分明确，功能确定，活性成分能够量化控制；提高动物增重和饲料转化效率；有效改善动物产品的肉质风味，提高产品质量；提高动物免疫力；符合安全、卫生、环保的条件要求，有利人类健康；动物死亡率减少5%以上。

同时，有效减少抗生素用量，无耐药性和残留，安全、无毒、纯天然。

1.2.2杜仲叶饲料添加剂的加工

（1）原料采集

绿原酸被认为是杜仲叶所含主要药用成分之。

汤诗杰等（1999）研究指出，不同地理种源杜仲叶片绿原酸含量有明显差异，季节性差异也极为明显。

研究同时对17个地理种源杜仲叶总黄酮含量进行了测定，结果表明，不同地理种源杜仲叶总黄酮含量差异显著，但春叶与秋叶的总黄酮含量无显著差异[12]。

陈芝龙等（2000）初步揭示了杜仲原料叶内含胶药成分动态变化规律，证明采收时间不同胶药品质差异较大，最佳的采收季节为药用叶8月份，胶用叶10月至11月中旬[13]。

由于种（系）、产地、采收时间和处理加工不同，杜仲叶及其产品中营养和生物活性成分含量也存在不同程度的差异。

因此，在科学研究、产品开发及实际应用中应当综合考虑其影响因素，不能仅以用叶量为依据。

（2）原料的预处理

原料的预处理可采用烘干法及沸水蒸法[14]。

蒸汽处理对鲜叶的穿透均匀，不会产生焦叶，叶子内部温度瞬时升高，使多酚类物质充分氧化，从而减轻了杜仲叶提取液的苦涩味，有利于各种活性成分的保留，提高了提取液的口感，且所用时间较短，因此，蒸发预处理要优于烘干法。

（3）杜仲叶的发酵

将杜仲叶经酵母菌、枯草芽孢杆菌进行发酵后，不仅可保持原有的营养成分，产生出许多有益的代谢产物，而且还有利于一些有效成分的分离和提取[15]。

发酵培养基是微生物生长的物质基础，适宜的培养基可有效提高杜仲液中有效成分如绿原酸的含量，改善口感、风味[16]。

1.2.3杜仲叶饲料添加剂研究现状

杜仲提取液对畜禽有增强免疫机制、改善动物产品风味的效果，并有维生素样促生长等作用，是很有发展前景的天然饲料添加剂[17]。

杜仲添加剂具有增强免疫和抗病力、抗应激、促生长、改善肉质等独特功效，具无毒、无公害、无残留等优点，饲养效果良好，经济效益明显，是一种天然中药饲料添加剂[18]。

当然，在杜仲叶饲料添加剂的研究课题中尚有一些问题有需要进一步探讨：

对杜仲所含不同成分单独和联合的药理作用、食品动物食后反应、最适剂量进行研究；加强以杜仲叶为原料的饲料添加剂研发，采取先进技术工艺和科学管理，生产出高效、低成本和使用方便的饲料添加剂产品，依产品性质或使用对象对产品分类并制定标准；加强动物试验，试验动物应包括所有主要食品动物，以及每种动物的不同生理生产阶段等[19]。

总之，对于杜仲叶应合理开发，制定科学的质量控制标准，完善加工工艺，使杜仲的有效成分真正进入生产性应用中，推动我国畜牧业发展。

1.3本研究的目的和意义

本研究以杜仲叶为主要原料，利用酵母菌、枯草芽孢杆菌等微生物对其进行发酵，并对发酵前后杜仲叶中绿原酸、多糖、蛋白质等成分进行对比分析，选出适宜的发酵菌种，为杜仲叶饲料添加剂的进一步开发奠定基础。

且我校浦口校区附近有近万亩的杜仲树林，若能合理开发，是极具经济效益及发展前景的。

是具有极高发展前及开发利用价值的饲料添加剂原料。

第二章实验部分

2.1实验材料

2.1.1菌种来源

本文采用酿酒酵母、假丝酵母以及两种枯草芽孢杆菌活菌对洞中也进行发酵，菌种均来自本实验室分离保存。

2.1.2杜仲叶样品来源：

本文采用杜仲叶分夏季与秋季两季采收，均采自江浦老山农场。

2.1.3主要试剂

表2-1主要试剂

Table2-1

试剂名称

纯度

生产厂家

马铃薯

葡萄糖

分析纯

中国惠兴生化试剂有限公司上海

牛肉膏

生化试剂

北京奥博星生物技术有限责任公司

蛋白胨

生化试剂

国药集团化学试剂有限公司

氯化钠

分析纯

国药集团化学试剂有限公司

氢氧化钠

分析纯

西陇化工股份有限公司

酵母浸膏

生化试剂

国药集团化学试剂有限公司

甲醇

分析纯

上海九亿化学试剂有限公司

绿原酸标样

99.0%

MadeinGermany

蒽酮

分析纯

国药集团化学试剂有限公司

硫脲

分析纯

江苏永华精细化学品有限公司

标准纤维素

浓硫酸

分析纯

上海九亿化学试剂有限公司

盐酸

分析纯

上海九亿化学试剂有限公司

氢氧化钠

分析纯

西陇化工股份有限公司

硼酸

分析纯

江苏永华精细化学品有限公司

硫酸铜

分析纯

江苏永华精细化学品有限公司

硫酸钾（硫酸钠）

分析纯

江苏永华精细化学品有限公司

硫酸铵

分析纯

江苏永华精细化学品有限公司

无水碳酸钠

分析纯

江苏永华精细化学品有限公司

2.1.4主要仪器

表2-2主要仪器一览表

Table2-2

仪器名称

型号

生产厂家

高压蒸汽灭菌锅

YXQ-LS-50S

上海博迅实业有限公司医疗设备厂

洁净工作台

SW-CJ-1FD

苏州安泰空气技术有限公司

摇床培养箱

TQZ312

上海精宏实验设备有限公司

电子天平

FA-2004

上海舜宇恒平科学仪器公司

超声波清洗器

KH3200

昆山禾创超声仪器有限公司

紫外可见分光光度计

Spectrumlab752s

Lengguangtech

电热恒温鼓风干燥箱

DHG-9076A

上海精宏实验设备有限公司

2.2实验流程

2.3发酵方法

2.3.1培养基

PDA培养基：

用于酵母菌的扩大培养。

需配置材料为马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL。

普通肉汤培养基：

用于枯草芽孢杆菌的扩大培养。

需配置材料为牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、水1000mL，调节pH至7.4。

灭菌条件：

121℃灭菌20分钟。

2.3.2菌种的扩大培养

（1）菌种的活化

将保存的菌种转接到液体培养基，加塞置于摇床培养箱中，转速140r/min。

酵母菌：

PDA培养基，27～30℃培养；

枯草芽孢杆菌：

肉汤培养基，37℃培养。

培养24h后，将菌种转接到新鲜的培养基中，同条件培养。

转接2～3次，完成活化。

（2）启动发酵

将杜仲叶粉碎后，称取8份15g置于8个250mL三角瓶中（杜仲叶平铺后可高出瓶底1.5～2cm），编号1～8，分别加水5mL。

配制含酵母膏0.25%、葡萄糖0.5%的水溶液。

取15mL分别加入至上述三角瓶中。

（3）接种摇床培养

1、2号三角瓶为酿酒酵母平行组，3、4号三角瓶为假丝酵母平行组，5、6号三角瓶为枯草芽孢杆菌1平行组，7、8号三角瓶为枯草芽孢杆菌2平行组。

菌种接种10%，置于摇床培养箱中，转速140r/min，培养4～5天。

酵母菌27～30℃培养，枯草芽孢杆菌37℃培养。

观察叶片变化。

2.4检测方法

2.4.1绿原酸含量测定

绿原酸是一种具有广泛生理活性和药理活性的物质，具有利胆、抗菌、降压、增加白血球及兴奋中枢神经系统、抗肿瘤、降脂、清除自由基等多种药理作用，对消化系统、血液系统和生殖系统疾病均有显著疗效。

测定绿原酸含量的方法很多，常采用毛细管电泳法、HPLC法、可见分光光度法和纸层析-紫外可见分光光度法等。

但样品处理均采用索氏回流提取，后经层析分离洗脱等步骤，时间长、效率低。

本文采用紫外可见分光光度法测定绿原酸含量[20]，只需超声波提取一小时，不经分离纯化而直接测定,具有快速准确、稳定性好等特点，适合大批量样品分析测试。

（1）波长的选择

根据绿原酸可溶于水、甲醇的性质，精密称取绿原酸标样0.5000mg，用50%甲醇溶液溶解定容至10mL，稀释10倍后于800～200nm范围内扫描，以50%甲醇溶液作参比，在325nm处有最大吸收峰。

另将绿原酸标准液点条样于层析纸上，用水作展开剂展开后，于紫外灯下去掉荧光部分（即绿原酸部分），其余部分用50%甲醇溶液超声提取15分钟，以50%甲醇作参比，在800～200nm范围内扫描，在345nm处有最大吸收峰，故选定345nm、325nm，为测定波长，其绿原酸吸光值为（A=A325-A345）。

（2）标准曲线测定

精密称取绿原酸标样适量，用50%的甲醇溶液稀释成每毫升含绿原酸5.05、10.1、15.15、20.2、30.3、40.4μg的标准溶液，以50%甲醇溶液作参比，在345nm、325nm处测定A345、A325值，求得A（A=A325-A345），以样品的浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制A-C标准曲线，求得回归方程为:

C=KA+B。

式中：

A——绿原酸标准溶液吸光度；

C——绿原酸标准溶液质量浓度，μg/mL；

K——斜率；

B——截距。

图3-1绿原酸标准工作曲线

Figure2-1

（3）样品的测定

精密称取杜仲叶粉0.5000g于60mL试管中，加入40mL50%甲醇溶液，放入超声波洗涤器中超声提取15min后过滤。

滤渣再加入40mL50%甲醇溶液，超声提取15min，共重复上述操作四次（三个平行），合并滤液定容至250mL。

在紫处可见分光光度计上以50%甲醇为参比，测定A325、A345值，求得绿原酸含量。

样品中绿原酸含量的计算公式为：

绿原酸含量%＝c*n/（106*m）

式中：

c——在标准曲线上得到的试样中绿原酸含量，mg/L；

n——稀释倍数；

m——为样品重量，g。

2.4.2多糖含量测定——蒽酮比色法[21]

（1）蒽酮试剂的配置

准确称取0.2g蒽酮和1g硫脲置于烧杯中，缓慢加入100mL浓硫酸，边加边搅拌，试剂溶解后呈黄色透明溶液，储存于棕色瓶中备用。

（2）纤维素标准溶液的配置

称取200mg标准纤维素，放入100mL容量瓶中，加60%的浓硫酸60～70mL,在30℃下消化20min，然后用60%的浓硫酸定容至100mL；吸取5.0mL放入另一50mL容量瓶中，冰浴条件下加蒸馏水稀释至刻度。

（3）样品消化

称取杜仲叶200mg，放入100mL容量瓶中，加60%浓硫酸60～70mL，在35℃下消化1h，然后用60%的硫酸定容；过滤后吸取5.0mL放入另一个50mL容量瓶中，冰浴条件下加蒸馏水稀释至刻度。

（4）纤维素标准曲线的制作

取6支小试管，分别加入0,0.4,0.8,1.2,1.6，2.0mL的纤维素标准液，然后分别加入2.0,1.6,1.2,0.8,0.4,0mL的蒸馏水，摇匀。

每管沿管壁加入5mL冷的蒽酮试剂，摇匀，加塞，沸水浴中加热10min，取出在流动水中冷却20min。

以空白管调零，620nm下测定各管的吸光值，以每管的纤维素的毫克数为横坐标，以每管的A620nm值为纵坐标制作标准曲线。

求得回归方程C=KA+B。

式中：

A——纤维素标准溶液吸光度；

C——纤维素标准溶液质量浓度，μg/mL；

K——斜率；

B——截距。

图3-2纤维素标准工作曲线

Figure2-2

（5）样品的测定

吸取消化好的样品溶液2mL，加入5mL冷的蒽酮试剂，如上操作，测A620nm值，对照标准曲线求出样品中的纤维素含量。

样品中纤维素含量的计算公式为：

纤维素含量（％）X=﹙C×D／M﹚×100

式中：

X——每百克样品总糖含量

C——在标准曲线上查得的糖含量（g）

D——稀释倍数

M——样品重量（g）

2.4.3蛋白质含量测定

本实验采用凯氏定氮法测量蛋白质。

蛋白测定中所用的化学药品：

浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、硼酸、硫酸铜、硫酸钾（硫酸钠）、硫酸铵，标定盐酸标准溶液用的无水碳酸钠为基准试剂。

第三章结果与讨论

3.1样品成分测定结果

表3-1样品成分测定结果

杜仲叶采收季节

绿原酸

蛋白质

多糖

灰分

秋叶

1.80%

12.39%

14.55%

22.14%

夏叶

1.67%

15.21%

16.32%

15.93%

Table3-1

由测定结果可以看出，秋叶与夏叶的成分含量存在差异。

实验结果显示，秋季采收的杜仲叶，其绿原酸的含量略高于夏季采收的杜仲叶。

并且，秋叶中的多糖（纤维素）含量低于夏叶，更易于消化。

灰分主要成分为氧化物和无机盐，具有重要的生理作用，而秋叶中的灰分含量明显高于夏叶。

秋叶中的蛋白质含量虽低于夏叶中蛋白质的含量，但明显高于优质粮食类玉米（9.4%）以及稻谷（7.8%）的蛋白质含量的标准[22]。

由此可见，杜仲叶可以作为很好的补充蛋白质以及灰分的饲料资源，并且在秋季采收为佳。

因此，本实验后期的发酵实验选用的杜仲叶为秋季采收的杜仲叶。

3.2发酵前后杜仲叶的成分变化

3.2.1绿原酸含量的变化

表3-2不同菌种发酵前后杜仲叶中绿原酸含量

Table3-2

酿酒酵母菌

假丝酵母菌

枯草芽孢杆菌1

枯草