透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的阻碍.docx

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透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的阻碍

透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的阻碍

吴益民王洪军孙艳吴琼冯立张志强杨青杨国平

【摘要】目的利用已含有血红蛋白基因（vgb）的红色糖多孢基因工程重组菌，探讨vgb表达产物对重组糖多孢红霉菌提高红霉素产率的阻碍。

方式用SDS-PAGE、Westernblot方式鉴定血红蛋白，用葡萄糖浓度与总蛋白质含量比较原始菌株与重组菌株的不同。

结果红色糖多孢基因工程重组菌与原始菌株比较，重组菌株发酵进程葡萄糖浓度的转变出此刻第二时段（约38h），原始菌株达到了L，而重组菌株只有L；第三时段原始菌株显现了游离葡萄糖浓度顶峰而重组菌株未显现。

在两个菌株中生物物质浓度［以总蛋白质（g/L）表示］存在不同，重组菌株比原始菌株约低27%。

红霉素效价，原始菌株和重组菌株别离为和L，相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29%。

结论重组红色糖多孢菌表达了透明颤菌血红蛋白，提高了红霉素产率，对解决抗生素工业和基因工程菌高密度发酵有良好的应用前景。

【关键词】透明颤菌；血红蛋白基因；红色糖多孢菌；基因重组

ABSTRACTObjectiveTostudytheexprssionofVitreoscillahemoglobingene（vgb）intheSaccharopoblyspouraerythraeaanditseffectonerythromycinproduction.MethodAvgbgenewasintegratedintothechromosomalDNAofbyelectrotransformationandtherecombinantwasobtained.TheVHbwasidentifiedwithSDS-PAGEandWesternblottingmethod.Glucoseconcentrationsandtotalproteincontentinoriginalandrecombinantstrainfermentationprocessesweredeterminedandcomparedwithauto-biochemicalassay.Theerythromycintitersweretestedwithcylinderplatemethod.ResultsAtthesecondstageoffermentation,glucoseconcentrationoforiginalstrainreachedLatabout38handthatofrecombinantstrainwasL;atthethirdstage,aglucoseconcentrationpeakappearedinoriginalstrainwhilenonedidinrecombinant.Thetotalproteincontentofrecombinantwaslowerthanthatoforiginalstrainby27%.ThetitresoferythromycininoriginalstrainandrecombinantwereandL,respectively,.thetheerythromycinproductionofrecombinantwasincreasedby29%comparedwiththatoforiginalstrain.Conclusionvgbgenewasexpressedinrecombinant,whichincreasederythromycinproductionandshowedabrightapplicationprospectofantibiotic-geneengineeringstrain.

KEYWORDSVitreoscilla;vgb;Saccharopolysporaerythraea;Genticrecombination

红霉素是由红色糖多孢菌培育液中分离出来的一种抗生素，每一年的产量有数千吨。

考虑到菌体进行大规模发酵培育时所处的特殊生长条件，只有在大规模的生物反映器中提高氧气的利用率，才能有效地提高红霉素的产量降低生产本钱，因此，寻求能够提高细胞利用氧气能力的途径是提高红霉素产量的关键。

透明颤菌血红蛋白（VHb）在多种异源菌株中取得成功表达［1，2］，是提高细胞利用氧能力的一条新途径。

本项研究将vgb基因引入红色糖多孢菌株，并在重组红色糖多孢菌株中成功地表达了血红蛋白，与原始菌株比较，在发酵进程中血红蛋白持续表达，提高了红霉素的产率，现将结果报导如下。

1材料与方式

材料

（1）菌株与质粒红色糖多孢菌2359（红霉素的工业生产菌）购自大连医药公司。

红色糖多孢菌的基因工程重组菌（染色体中已整合了Vitreoscillahemog-lobingene，vgb）本实验室构建。

红霉素生物检测的检定菌和藤黄微球菌（Micrococusluteus）28001购自大连医药公司。

（2）试剂红霉素标准品购自Fluka公司。

葡萄糖、正丙醇、糊精、培育基与经常使用化学试剂和免疫试剂均购自上海生物工程公司。

（3）仪器及设备日本SANYOMS-3020型高压灭菌锅；美国BeckmanJ2-21型低温离心机；瑞士INFORS公司生产的Minifors实验室小型发酵罐和Techfors-S中试型发酵罐；宁波新芝科仪器研究所生产的超声波细胞粉碎仪；惠普上海分析仪器生产的7320分光光度计。

方式

（1）重组红色糖多孢菌载体的构建与工程菌株的挑选见文献［3］。

（2）透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌中表达将重组糖多孢红霉菌发酵培育物100ml离心，搜集菌体。

每克菌体加入3ml的裂解液悬浮细菌，加入溶菌酶至终浓度100μg/ml，1/10体积的1%TritonX-100震荡混匀，30℃水浴15min，置冰浴中超声处置（功率：

200～300w，每次60s，距离10s），将裂解液12000r/min离心15min，溶菌沉淀和上清中加入100μl2×SDS-PAGE缓冲液，当即进行SDS-PAGE电泳分析表达产物（分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%）。

具体操作方式参照文献［4］。

（3）红色糖多孢菌的补料培育工程菌的发酵分3级进行。

取一级种子35ml在S2培育基中进行摇瓶培育，48h后转移至含S3培育基的5L的小型发酵罐中，进行二级种子培育。

搅拌转速为800r/min，空气流量，温度34℃。

培育进程中检测溶解氧压（DOT）、pH值和氧化还原电位的转变，并在线监测排气中的二氧化碳和氧气的浓度。

40h后取的二级种子转移至20L的中试型发酵罐中，发酵罐中事前加入10L浓度减半的S4发酵培育基。

温度34℃，pH值，搅拌转速初始值为700r/min，当DOT低于45%的空气饱和度时提高搅拌转速到900r/min；空气流量在前12h为，然后上调至，开始补料后再下调为；反映器上方空气压力操纵在。

发酵进程中的补料，12～160h按（L·d）的速度补加正丙醇；25h到发酵终止区间按（L·d）的速度补加豆油；30～90h按48ml/（L·d）的速度补加15%糊精。

低流速时通过补料泵每分钟补入适当的量，高流速时可持续补料。

（4）葡萄糖浓度测定按六、38和96h梯度时刻按时取样，以生化分析仪检测葡萄糖浓度，同时设对照组。

（5）发酵液中总蛋白含量的测定采纳标准Folin-酚试剂反映（Loury法）定量测定总蛋白浓度。

以牛血清白蛋白作为标准品，绘制标准曲线。

取样发酵液主若是菌球、菌丝、不溶性物质和少量液体，由于干扰细胞干重的直接测定，因此发酵液样品经碱性水解处置后，再通过标准Loury法测定其吸光度（A），将样品的光密度读数在标准曲线上查出相应的标准牛血清白蛋白溶液的浓度。

（6）红霉素效价的测定采纳管碟法，具体操作参考微生物检测方式［5］。

2结果

透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌中表达

取重组糖多孢红霉菌发酵培育物裂解液40μl，经SDS-PAGE检测，重组红色糖多孢菌株在处有一条特点性的蛋白泳带，而原始对照菌株那么没有（图1）。

发酵进程中游离葡萄糖的浓度的比较

从图2中能够看出红色糖多孢菌原始菌株和重组菌株在发酵进程中游离葡萄糖的浓度存在不同。

原始菌株在3个时段检测出了游离葡萄糖，第1时段是接种后12h内，游离葡萄糖浓度达到约L；第2时段是38h左右，糊精补料已经开始；第3个时段96h左右是糊精补料终止。

原始菌株第2时段游离葡萄糖浓度较高，达到L，而重组菌株只有L；原始菌株显现了第3时段游离葡萄糖浓度顶峰，而重组菌1：

分子量标记物；2：

原始菌株；3：

重组菌株株却没有。

发酵进程中总蛋白浓度的比较

红色糖多孢菌的原始菌株与重组菌株发酵液中生物物质浓度［以总蛋白（g/L）表示］存在着不同，见图3与表1。

重组菌株比原始菌株约低27%，说明重组菌株的生长率较低。

发酵进程中红霉素的效价比较

本实验比较了在发酵进程中3批红色糖多孢菌原始菌株与重组菌株产生红霉素的平均效价曲线，原始菌株与重组菌株的最终红霉素效价别离为和L，即重组菌株提高红霉素体积产率约29%，这种提高是生物合成速度增加的结果。

计算48～144h红霉素产率，重组菌株为（L·h），原始菌株（L·h）。

重组菌株红霉素效价较高，生物物质浓度低24%～50%，使重组菌株的红霉素比产率高出原始菌株约1倍，见图4与表1。

3讨论

工业生产上，重组菌株红霉素的产量及其遗传稳固性是相当重要的。

本项实验采纳类似的工业生产进程进行发酵罐实验，结果说明，重组菌株产红霉素的最终效价比原始菌株提高29%，重组菌株的高产率加上表1红色糖多孢菌原始菌株和重组菌株的生物量（略）

持续的高效价关于提高整个发酵进程的日产率具有重要意义。

例如，重组菌株在144h时的红霉素产率达到（L·d），而原始菌株在192h的产率仅为（L·d），前者的产率高出后者40%。

原始菌株游离葡萄糖浓度顶峰的显现与红霉素产率下降也呈现相一致的情形，重组菌株在消耗葡萄糖量增加的情形下，总蛋白浓度显著减少，使红霉素产量增加了29%，说明重组菌株比原始菌株代谢活性大大提高，这正是工业生产中所期待的理想成效。

有关vgb提高红霉素的产量机制问题，Toshi［6］的实验证明VHb可作为氧气的载体和贮存物而起作用，VHb与氧结合生成十分稳固的氧合态，并以氧合态形式直接参与细胞的生理进程。

VHb具有运输氧和传递电子的功能，VHb合成于细胞质中并聚集在细胞膜周围，在限氧条件下能够捕捉氧，并协助氧传递到生命力旺盛的呼吸膜上［7，8］，改变细胞原有的代谢功能。

到目前为止，对vgb的引入而显现菌体总蛋白含量降低的现象，仍未能作出令人中意的说明，咱们以为可能是微生物体内的生化代谢途径复杂。

当一个代谢途径发生改变时，生物体内发生代偿反映，表现为某些功能的开放或关闭，以适应环境的协迫。

VHb在红色糖多孢菌的重组菌株中的表达可能正是依照上述原理阻碍红霉素的生产。

尽管过去的研究说明［6］，在60%～10%DOT的微通气条件，乃至厌氧条件下，红霉素比产率并未改变。

但这些研究结果是在合成培育基顶用低产菌株（红霉素效价100～200mg/L）取得的，未必能类推至本研究中所采纳的生产菌株及其进程。

Minas［9］报导，在vgb转入红霉素发酵菌株后，红霉素的体积产率提高了约70%，但本研究中体积产率仅提高了29%，推测可能是由于本研究中所用的发酵原始菌株本身就已是通太高度突变和挑选而取得的生产菌株，因此，再提高的幅度不大。

【参考文献】

［1］陈文清，喻子牛，郑应华.透明颤菌血红蛋白基因在弗氏链霉菌中的表达及其对菌丝生长和泰乐星合成的阻碍［J］.中国抗生素杂志，2004，29（9）：

516～518.

［2］张桂敏，周秀芳，邓子新.透明颤菌血红蛋白基因（vgb）在阿维链霉菌的整合表达［J］.中国抗生素杂志，2005，30（3）：

1389～1390.

［3］吴益民，王洪军，孙艳，等.vgb在红色糖多孢菌表达及生物活性的研究［J］.药物生物技术，2007，14

（2）：

90～93.

［4］F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿等.精编分子生物学实验指南［M］.北京：

科学出版社，1998：

625～657.

［5］马绪荣，苏德模主编.药品微生物学手册［M］.北京：

科学出版社，2001：

229～239.

［6］ToshiM,MandeS,DikshitKL.HemoglobinbiosynthesisinVitreoscillasterecorariaDW:

cloning,expression,andcharacterizationofanewhomologofabacterialglobingene［J］.ApplEnvironMicrobiol,1998,64（6）:

2220～2228.

［7］张志强，吴琼，王洪军，等.透明颤菌（沈阳株）血红蛋白基因克隆与测序［J］.生物技术，2005，15（6）：

1～2.

［8］孙艳，郑煜焱，王洪军，等.透明颤菌血红蛋白基因的克隆与表达［J］.中国公共卫生，2005，21（4）：

436～437.

［9］MinasW,BrunkertP,KallioPT,etal.ImprovederythromycinproductioninageneticallyengineeredindustrialstrainofSaccharopolysporaerythraea［J］.BiotechnolProg,1998,14（4）:

561～566.