生化实验报告数据处理.docx
《生化实验报告数据处理.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生化实验报告数据处理.docx（22页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
生化实验报告数据处理
生
化
实
习
报
告
班级：
生物技术08
指导教师：
敖新宇、贾璐
学号：
姓名：
日期：
2009-12-19
生物化学综合实验
摘要：
本次实验包括苯丙氨酸解氨酶的纯化及其活性测定和大玉米粉中营养成分的测定两个实验。
关键词：
苯丙氨酸解氨酶、SephadexG—25层析、DEAE纤维素层析、活力、比活力、大玉米粉、凯式定氮法、索式提取法、3，5—二硝基水杨酸比色法。
实验一苯丙氨酸解氨酶的纯化及其活性测定
一实验目的
1.学习掌握分离纯化生物大分子的方法；
2.学习掌握酶活性的测定方法；
3.了解在分离纯化过程中酶活性的变化；
4.了解高速冷冻离心机的操作步骤
二实验原理
苯丙氨酸解氨酶（L—phenylalanine:
ammonialyase,简称PAL；EC4.3.1.5）是
植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切相关，在植物生长发育和抵制病菌侵害过程中起重要作用。
PAL催化L—苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。
规定1h内增加0.01为PAL的一个活力单位。
酶的比活力是指样品中每毫克蛋白质所含的酶活力单位数。
在实验中将会看到随着PAL的逐步被纯化，其比活力也在逐步增加。
在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析。
溶液的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱和溶液称100%饱和度。
沉淀一种酶所需的具体浓度需要经实验确定。
Sephadex（交联葡萄糖凝胶）是有细菌葡聚糖长连，用交联剂1—氯2—，3—环氯丙烷交联而成。
凝胶商品名后面的G值表示每克干胶吸水量（毫升数）的10倍。
交联度大，网孔小；交联度小，网孔大。
交联度的大小还与凝胶颗粒的机械强度有关，交联度大，机械强度也大（硬胶），在柱层析中流速快。
根据需要，选用一定型号的的凝胶柱做柱层析介质（蛋白脱盐一般用G—25或G—50，G—100~G—200分离不同分子质量的蛋白组分）。
由于被分离物质的分子大小和形状不同，分子质量大的进入凝胶网孔中被阻滞，从而后流出层析住，达到分离的目的。
DEAE纤维素是以天然纤维素为母体联结了二乙基氨基制备而成的。
DEAE纤维素柱层析属于阴离子交换层析的一种，DEAE纤维素经过处理上柱后，由于静电吸力等可吸引在固定相和流动相中的一些阴离子（如ＯＨˉ、Clˉ等）。
蛋白质粉在水溶液中可以作为两性解离，控制溶液PH，可使蛋白质分子或成为阴离子，或成为阳离子。
对于DEAE纤维素而言，应使酶溶液PH大于酶蛋白分子的PH，使其成为阴离子。
在实验中还要测定蛋白质的含量，用考马斯亮蓝法。
考马斯亮蓝法是染料结合法的一种。
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者的最大光吸收在456nm。
在一定的蛋白质浓度范围内（0—100微克/毫升），蛋白质-色素结合物在波长595nm处的光吸收与蛋白质的含量成正比，故可以用蛋白质的定量测定。
而且该反应非常灵敏，可用于测微克级蛋白含量。
三、实验器材
1.材料：
土豆
2.仪器：
高速冷冻离心机、研钵、恒温水浴锅、电子天平、试管、烧杯、剪刀、量杯、层析柱、移液枪、胶头滴管、蛋白质核酸自动分析仪、紫外分光光度仪、可见分光光度仪。
3.试剂：
0.1mol/L硼酸—硼砂缓冲液（PH8.7）、酶提取液：
硼酸—硼砂缓冲液（含0.1mol/LEDTA、20mol/Lβ-巯基乙醇）、0.6mol/LL-苯丙氨酸溶液、6mol/LHCL、固体硫酸铵、0.02mol/L磷酸盐缓冲液、sephadexG-25、DEAE纤维素52、标准蛋白质溶液（100µg/mlmL）、考马斯亮蓝G-250蛋白质染色液。
四、实验步骤
1.酶液体取
（1）用电子天平称去土豆5g，剪成小段，加入体积酶提取液，于冰浴上同时加半勺左右的石英砂，用研钵研成浆。
（2）用胶头滴管将已经匀浆的酶液转入离心管，再用少量的提取液冲洗研钵及研棒，将冲洗液转移到同一个离心管中，在1000转离心10分钟。
（3）取离心后的上清液（即粗酶提取液），倒入量筒量出其体积（14.0ml），放置冰箱中备用。
（4）从酶粗体取液中吸出1mL于eppendorf管中保留，作为后面活力测定用（贴好标签，置于冰箱中）。
2.硫酸铵分级沉淀酶蛋白
（1）余下的酶液根据实际体积、温度和硫酸铵饱和的用量表，算出达到38%饱和度应加入的酶液中的硫酸铵量（38%饱和100ml加硫酸铵21.32g），并称硫酸铵（3.6904g）。
（2）将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌加入称好的硫酸铵，待全部加完后，在缓慢搅拌10min，静置10min；然后在1000r/pm下冷冻离心10min，保留上清液于烧杯中（上清液体积为3.5ml）。
（3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵量（75%饱和100ml加硫酸铵26.3g），算出后加入3.6904g硫酸铵。
（4）按上述方法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。
（5）将沉淀溶于2mL酶提取液中，取1mL也eppendorf管中保留，作为后面活力测定用（贴好标签，置于冰箱中）。
3.SephadexG—255g，加入适量的0.02mol/L磷酸盐缓冲液，在室温下溶胀。
待溶胀平衡后，虹吸去上清液的细小颗粒，这样处理2～3次。
（2）装柱：
固定好层析柱，柱保持垂直，将20mL蒸馏水装入柱内，打开止水夹赶出去口内气泡，当柱内保留1mL左右水层时，把处理好的SephadexG—25用玻璃棒搅匀，尽量一次加入柱内，将胶床表面仅有1～2cm液层时，旋紧止水夹。
装好的胶柱应无气泡、无节痕、床面平整，床面铺一张圆形滤纸。
（3）上样：
让胶床表面几乎不留液层，将1mL酶液小心注入胶床中央，注意不要冲坏床面，吸取1mL磷酸盐缓冲溶液，把吸附在玻璃壁上的沉淀洗入住内，在床面仅有1mL左右液层时，再小心的用胶头滴管加入5～6cm高的磷酸盐缓冲洗脱。
（4）洗脱收集：
用自动收集仪收集洗脱液，取刻度试管5支,编号，床柱面上不断加磷酸盐缓冲液洗脱（控制滴速），每管收集3mL。
（5）打开检测仪以及记录仪。
（6）将出现峰值的试管收集在一起，吸取1mL于eppendorf管中保留，作为后面活力测定用（总体积为3.9ml，然后贴上标签，置于冰箱中）。
4.EDAE纤维素朱梯度洗脱
（1）称取DEAE纤维素52干粉1～1.5g，加20mL的0.02ml/L磷酸盐缓冲液浸泡4小时以上（或浸泡过夜）。
（2）装柱:
把预处理的DEAE纤维素52装柱（方法及要求同凝胶层析柱）。
装柱完成后，用2～3个床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡该柱。
（3）上样：
把所得酶洗脱液小心注入柱床面中央，所有注意点和方法也与凝胶层析中上样相似。
上样结束后，在床面以上加入2～3cn液层，注意上样就开始收集流出液。
（4）洗柱：
约用2倍体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液洗柱，收集洗柱液。
按洗脱管编号，每隔3管取洗脱液0.1mL，测各管中PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脱液，吸取1mL于eppendorf管中保留，作为后面活力测定用（体积为7.0ml，然后贴好标签，置于冰箱）。
5酶活力测定
（1）取试管10支，按表中加入各溶液
试管编号
测定调零
对照调零
测定1
对照1
测定2
对照2
测定3
对照3
测定4
对照4
0.1mol/L硼酸缓冲液（ml）
4.00
4.00
3.90
4.90
3.90
4.90
3.90
4.90
3.90
4.90
酶液（ml）
—
—
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.6mol/L苯丙氨酸溶液（ml）
1.00
1.00
1.00
—
1.00
—
1.00
—
1.00
—
（2）将各管混匀，放入40℃恒温水浴保温1h，到时加入0.2ml2mol/LHCl终止反应。
（3）紫外分光光度计预热10min,于波长290nm处测定各管的A290
6.蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）
（1）取酶液0.1ml,用蒸馏水稀释至5ml。
（2）取12支试管分为两组，按下表加入各溶液：
试管编号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白溶液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
考马斯亮蓝（ml）
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
（3）将上述各管混匀，静置2min，测定各管的A595
（4）取8支试管分为两组，按下表加入各溶液：
试管编号
7
8
9
10
稀释酶液（ml）
1.0
1.0
1.0
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
1.0
1.0
1.0
考马斯亮蓝（ml）
2.0
2.0
2.0
2.0
注：
粗酶提取液取0.1ml，加入4.9ml蒸馏水，稀释50倍；
硫酸铵沉淀0.1ml，加入9.9ml蒸馏水，稀释100倍；
凝胶层析稀释0.1ml，加入4.9ml蒸馏水，50倍。
（5）将上述各管混匀，静置2min，测定各管的A595
五实验结果处理
1.酶活力测定
试管编号
测定调零
对照调零
测定1
对照1
测定2
对照2
测定3
对照3
测定4
对照4
A595
0.0000
0.0000
0.0826
（0.1263）
0.1006
（0.1294）
0.0431
0.419
0.0226
0.0013
0.0215
0.0188
注：
（括号内的数值为将加热时间缩短为5min后的重复实验的数值，计算时不取括号内数值）
试管编号
∣测定1－对照1∣
∣测定2－对照2∣
∣测定3－对照3∣
∣测定4－对照4∣
A
0.0180
0.0012
0.0213
0.0027
总活力
90.0
12.0
106.5
2.7
注：
总活力计算公式：
总活力=稀释倍数*A／0.01
粗酶提取液稀释50倍
硫酸铵沉淀稀释100倍
凝胶层析稀释50倍
离子交换层析没有稀释。
;
2.标准蛋白测定
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
实验组1
0.000
0.126
0.221
0.399
0.481
0.553
0.469
0.389
0.258
0.413
实验组2
0.000
0.196
0.409
0.484
0.661
0.677
0.521
0.279
0.222
0.528
平均值
0.0000
0.1610
0.3150
0.4415
0.5710
0.6150
0.4940
0.3340
0.4800
0.4705
蛋白质微克数
0
20
40
60
80
100
注：
6—粗酶；7—硫酸铵沉淀；8—凝胶层析；9—离子交换层析
由蛋白质标准曲线可得：
试管编号
6
7
8
9
蛋白质含量（ug）
72.1
47.4
70.0
68.5
5.PAL总活力、比活力、蛋白质含量计算
步骤
体积（ml）
蛋白质含量（mg）
总活力（m）
比活力（m/mg）
粗提
1.0
3.605
90.0
20
硫酸铵沉淀
1.0
4.740
12.0
2.5
凝胶层析
1.0
3.500
106.5
30
离子交换层析
1.0
0.068
2.7
39.7
注：
PAL比活力计算
酶的比活力=酶液中PAL总活力单位数／酶液中蛋白质mg数
实验讨论:
1.为保证酶活性，整个实验尽量在低温下进行；
2.层析主要与地面垂直，加样时要小心，避免冲坏柱床表面；
3.蛋白质与考马斯亮蓝G—250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。
因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低；
4.加样和洗脱凝胶床平衡后，在床顶部留下数毫升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。
一般样品体积不大于总床体积的5%~10%。
样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘稠度将随浓度的增大而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘稠度不得超过1.5—2。
样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相切时，再加入数毫升洗脱液冲洗管壁，当其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设定好流速，然后分布收集洗脱液，并对每一份馏分做定性、定量测定；
5.由于我们在收集离子交换层析时流速测定过快，记录仪灵敏度偏高，导致峰不明显。
实验二各种谷物中营养成分的测定
一、实验目的：
1、掌握样品中蛋白质含量的测定方法—凯氏定氮法
2、掌握测定食物中的灰分、水分、油脂及碳水化合物的方法
二、试验原理：
（一）大玉米粉中粗蛋白的测定（凯氏定氮法）
谷物是人类特别是发展中国家人民的主要蛋白质的来源，谷物中蛋白质的含量是衡量其食品和营养价值的最重要的指标。
对现有的谷物的进行评价、利用，对大批原始材料（种质资源）及育成品系筛选，都需要测定种子蛋白质的含量。
测定蛋白质含量的方法很多，一般可分为直接法和间接法两大类。
本次试验采用凯氏定氮法来测定蛋白质。
含氮化合物（如：
蛋白质）与浓硫酸共热，含氮化合物既分解产化，氨气与浓硫酸作用，生成硫酸铵。
经强碱（如：
生氨气（消化），氨气又与浓硫酸作用，生成硫酸铵。
经强碱（如：
30%—40%的氢氧化钠）碱化使之分解放出氨气，使蒸汽将氨气蒸至酸液中（一般为硼酸），氨与酸液中的氢离子结合生成铵根离子，使溶液中的氢离子浓度下降。
用标准盐酸滴定，根据此酸被中和的程度，可计算样品的含氮量。
主要有以下反应：
消化：
Protein+H2SO4（浓）→（NH4）2SO4+CO2↑+SO2↑+H2O
蒸馏：
（NH4）2SO4+2NaOH→2NH3↑+Na2SO4+2H2O
吸收：
2NH3+4H3BO3→（NH4）2B4O7+5H2O
滴定：
（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO4
η粗蛋白=（C盐酸ΧV滴定体积Χ14Χ含氮系数）∕M样品总质量Χ100%
三、试验器材及材料
1、仪器：
电子天平、定氮仪、消化炉、消化管5支、排污管、不锈钢架、消化架、干燥器、三角锥瓶250mlΧ5、微量滴定管、移液管（10ml1个、2mlΧ2、1mlΧ1、0.5mlΧ1）、水桶
2、硫酸铜、硫酸钾、葡萄糖、50%氢氧化钠、4%硼酸、0.1mol/L盐酸
3、材料：
玉米粉
四、试验步骤：
1、消化
（1）消化样品前，要将实验仪器洗干净并烘干。
同时将样品研磨成粉末状。
（2）用电子天平准确称取原料大玉米粉0.5000ɡ左右（两份），用硫酸纸桥加入消化管底部。
（注意：
称量样品的时候，要用硫酸纸；加样品时避免将样品粘到消化管壁）。
（3）同样用电子天平准确称取0.5000g硫酸铜（催化剂，两份）和3.000g硫酸钾（提高硫酸的沸点，两份），也用硫酸纸桥加入消化管底部。
（4）用移液管取10ml浓硫酸加入消化管（注意：
浓硫酸具有强烈的腐蚀性，避免占到皮肤、衣服上以及地面上；如有溅出应立即清除）。
（5）另作两空白对照，消化管中加入0.5000g葡萄糖，其他与上管相同。
（6）架好消化管，将消化管的管口与排污管的衡梁用密封圈封好，两端用皮管接好通入盛满水的水桶中。
（7）接通电源，初始消化时电压调至90V，半小时后调至180V。
待消化管变至澄清的绿色继续加热半小时。
关闭电源前，要先将皮管从水桶里拿出，再关闭电源。
（8）静置至消化管变冷，备用蒸馏。
2、蒸馏
（1）定氮前，要按说明接好水管，检查仪器是否正常。
（2）用一只消化管接在蒸汽入口处，要密封，在放250ml的三角瓶在氨气出口管，打开冷凝管，开启仪器，蒸汽清洗定氮仪半个小时。
（将NaOH管通入50%的NaOH溶液中，打开NaOH开关，抽提溶液进入消化管中，关闭NaOH开关，为了让整个NaOH管路中的水被NaOH替换）。
（3）清洗完毕后，关闭电源。
用盛有样品的消化管换下空消化管，用盛有50ml的4%硼酸的三角瓶替换空三角瓶，加1～2滴指示剂到硼酸三角瓶中，升高三角瓶直至出氨的玻璃管完全浸到硼酸液面下。
（4）将NaOH管通入50%NaOH中，打开NaOH开关，进50ml溶液进入消化管中，关闭NaOH。
（5）打开进水开关，仪器启动完毕。
（6）当三角瓶溶液中的颜色变为蓝色继续蒸馏10min，调低三角瓶，用洗瓶冲洗氨出口管，关闭定氮仪。
（7）用空消化管替换蒸馏完毕的消化管，同时用空三角瓶替换溶液颜色变为蓝色的三角瓶。
启动仪器，并且将NaOH管通入蒸馏水中，打开NaOH开关，吸取三次蒸馏水，冲洗管道中的浓碱。
清洗半小时，关闭仪器。
（8）用0.1mol/LHCL滴定变色溶液，直至溶液颜色变为没有通入氨前的颜色。
记录体积。
（9）计算样品中的含氮量。
3、样品中含氮量的计算
η粗蛋白=（0.1mol/L×V滴定体积×14×含氮系数）/M样品总质量×100%
（含氮系数随种子的不同而不同）
二粗脂肪含量的测定
（一）实验原理
高级脂肪酸与丙三醇或高级一元醇能生成单脂，单脂在与磷酸、含氮碱基或糖类结合可构成。
单脂和复合脂参与细胞、细胞器等结构的形成，具有多方面的生物学功能。
高级脂肪酸中的亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等是人和动物的必须脂肪，完全依赖从食物中获得。
因此，生物材料或农产品中的高级脂肪酸组分的分析在生物科研和食品营养评价中具有重要的意义。
油脂易容于乙醚、石油醚或乙烷中，利用脂类物质溶于有机溶剂的特性，可用有机溶剂提取。
在索氏提取器中用有机溶剂（本实验用乙醚，沸程30—60度，因采用沸点低于60℃的有机溶剂，不能提取出样品中结合状态的脂类，故此法又称游离脂类定量法）对样品的脂类进行提取。
索氏提取器是有提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成，提取管两侧分别有虹吸管和连接管。
各部分连接处要严密不能漏气。
提取时，将待测样品包在脱脂滤纸包内，放入提取瓶内。
提取瓶内加入乙醚。
加热提取瓶，乙醚气化，由连接管上升进入冷凝器，凝成的液体滴入提取管内，浸提样品中的脂类物质。
待提取管内乙醚液面达到一定高度，溶有粗脂肪的乙醚虹吸管流入提取瓶。
流入提取瓶的乙醚被加热气化、上升、冷凝、滴入提取瓶内，如此循环往复知道抽提完为止。
本法为重量法，将由样品提取的粗脂肪，蒸去溶剂，干燥，称重，渴求出粗脂肪的百分含量。
（二）实验器材和材料
1．仪器：
抽提瓶2个、虹吸管、冷凝管、蝴蝶夹、水浴锅
2．材料：
玉米粉、乙醚
（三）试验步骤
1、将抽提瓶洗干净后放入几粒沸石，然后放入烤箱中恒温至恒重备用。
2、将水浴锅加入纯净水备用。
3、称取试验材料5.000g，用滤纸包裹后放入抽提瓶中，慢慢加乙醚于抽提筒内至溶剂稍高于虹吸管，使乙醚流入烧瓶中，然后再加入乙醚至虹吸管的1/3处（注：
乙醚不能超过50ml），装上冷凝管回流提取，调节水浴锅温度，使乙醚冷凝后下滴速度为2滴/秒。
4、提取1.5小时后，当乙醚从提取器中全部流回烧瓶中便可以停止加热，提高冷凝管，用镊子取出滤纸筒，再放下冷凝管，继续蒸馏。
当乙醚快要达到虹吸管的高度时停止加热，待冷凝管中不滴下乙醚后移走冷凝管，取出提取筒，将乙醚由虹吸管中倒入回收瓶中，重新安装好仪器，继续蒸馏，至冷凝管中不再滴下乙醚时即可停止加热。
5、拆下仪器，取出平底烧瓶放到烤箱中恒温至恒重，用差量法称出油脂的质量，计算含油率：
η=【M油脂质量×100%】/M样品总质量
三、还原糖及总糖的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法）
（一）试验原理
测定还原糖和总糖的含量以往都是采用3，5-二硝基水杨酸比色法，各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和单糖彻底水解成有还原性的单糖。
此法运用广泛，操作简单，准确度高，没有什么对材料的限制，因此，本次试验还原糖和总糖的测定亦采用此方法。
在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原成3―氨基―5―硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。
（二）试验器材和材料
1、仪器：
电子天平、分光光度计、试管25ml×12、离心管、三角瓶100ml、烧杯100ml、容量瓶100ml×3、移液管（1ml×1、2ml×4、10ml×1）、恒温水浴、沸水浴、离心机
2、材料：
玉米粉、1mg/ml葡萄糖标准溶液、3，5-二硝基水杨酸、碘―碘化钾溶液、酚酞指示剂、6mol/L盐酸、6mol/L氢氧化钠
（三）试验步骤
1、制作葡萄糖标准曲线
取7支25ml刻度试管，编号，按下表操作：
试剂
管号
1
2
3
4
5
6
葡萄糖标准溶液（ml）
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
蒸馏水（ml）
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
3，5-二硝基水杨酸（ml）
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
0.75
将个试管摇匀，在沸水中加热5min，取出后立即冷却至室温，再加10ml蒸馏水，混匀。
在540nm波长下，以1号管调零，分别测定其余试管的吸光度。
以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。
3、样品中还原糖和总糖含量的测定
（1）样品中还原糖的提取：
准确称量3g样品，放入100ml的三角瓶中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50ml蒸馏水，摇匀置于50度恒温水浴中保温20分钟，使还原糖浸出。
将浸出液（含沉淀）转移到50ml离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀可用20ml蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
（2）总糖的水解和提取：
准确称量1.00g样品，放在100ml的三角瓶中，加入15ml蒸馏水及10ml6mol/L盐酸，置于沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘―碘化钾溶液检查）。
待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/L氢氧化钠中和至微红色，用蒸馏水定容在100ml的容量瓶中，混匀。
将定容后的水解液过滤，取滤液10ml，移至另一100ml容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。
（3）显色与比色
取4支25ml刻度的试管，编号，按下表所示操作
管号
还原糖测定试管
总糖测定试管
a
b
c
d
还原糖待测液（ml）
0.5
0.5
―
―
总糖待测液（ml）
―
―
0.1
0.1
蒸馏水（ml）
0.5
0.5
0.9
0.9
3，5-二硝基水杨酸（ml）
0.75
0.75
0.75
0.75
升级会员 