大肠菌群实验报告.docx
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大肠菌群实验报告
大肠菌群实验报告
篇一：
大肠杆菌检测实验报告
国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数
实验目的
实验原理：
国标法操作的原理
实验器材：
培养箱，10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，试管架，4个平皿，500ml大烧杯1个，电子天平，纱布，脱脂棉，灭菌锅，PH计或PH试纸，100ml量筒，橡皮手套，超净台
实验药品：
磷酸盐缓冲液，蒸馏水，LB培养基，琼脂，5%NaOH，5%HCl
实验步骤：
一：
10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，4个平皿，500ml大烧杯1个，100ml量筒进行洗涤，然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。
灭完菌后烘干，完成后放入超净台中。
用酒精擦拭超净台，紫外消毒30min
二：
1：
用电子天平称取成品LB3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。
2：
用量筒量取125ml的蒸馏水加入该锥形瓶中，制成培养基。
3：
用棉花堵住该锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口，用橡皮筋扎牢，再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。
4：
灭完菌后放入超净台中备用。
三：
1：
取1只无菌250ml锥形瓶，用量筒向其中加入49mlPBS
2：
将1ml样品加入到该锥形瓶中，摇匀制成1:
50的细菌溶液。
3：
取4只试管，编号1—4
4：
用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS
5：
用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。
6：
用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中，摇匀
7：
用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取１ｍｌ细菌溶液，加入3中，摇匀．．．．．．以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。
9：
取4只平皿，编号1—4
10：
分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取１ｍｌ的菌液置于4只平皿中，加入４５—５０摄氏度温度下的培养基，约１５ｍｍ厚度。
缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀；待培养基冷凝后倒置。
11：
将培养基在３6摄氏度条件下培养12小时。
12：
取出培养皿，选择细菌个数在30至300个之间的平皿数细菌的个数。
四：
实验结果（记得在操作过程和得到结果时拍照）
1号，2号菌落个数多不可计，舍弃
4号平皿中菌落数目小于10cfu，舍弃
3号平皿中菌落分布较均匀，数3号中的菌落数，一共有210个cfu。
计算样品中细菌浓度为：
1.05×105Cfu/ml
点评
超净台中的实验步骤讲述详细，明确，不错。
前面的步骤叙述有点乱，建议按照如下标题重新调整顺序。
实验步骤：
1、仪器清洗
将烧杯，培养皿、试管等仪器用洗衣粉清洗，超声5min.然后用清水清洗，超声5min,最后用三蒸水清洗，放入烘箱中烘干。
2、培养基配制
精确称量。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
放入锥形瓶中，加入。
。
。
。
mL蒸馏水，摇匀
3，灭菌
包扎、灭菌，烘干备用
3、超净台中的操作（如上）
除了实验步骤和结果，还要有讨论和注意事项
例如：
实验讨论：
1、评价该方法（操作简易程度，灵敏度如何，适用性）
2、为何选择细菌个数在30至300个之间的平皿数细菌的个数？
注意事项
比如各种仪器的使用注意事项，以及保持洁净，防止染菌等。
篇二：
大肠杆菌实验报告
大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选
0740063阿噟兰
1.前言
抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。
但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。
在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。
当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。
如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。
DNA对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DNA结构变化的形式有DNA链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。
因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。
一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265nm。
选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。
在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。
本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。
若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。
紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。
因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。
在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。
2.材料和方法
2.1实验材料、仪器和试剂菌种：
大肠杆菌
仪器：
超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器
试剂：
牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养基
普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：
牛肉膏5g蛋白胨10gNacl5g琼脂20g蒸馏水1000mlPh7.0
按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml
筛选培养基（200ml）：
含抗生素50mg/L。
（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成。
）
牛肉膏5g蛋白胨10gNacl5g琼脂20g蒸馏水1000mlPh7.0硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）0.2ml，按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌，取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素0.2ml加入培养基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml2.2.2制备菌悬液（106~108个/mL）
①固体培养：
大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。
②菌悬液：
用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌
体散开，得到菌悬液。
③菌悬液浓度用血球计数板计数
使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。
将菌液滴在血球计数板0．1ml的计数格中，细菌被固定染色后，在显微镜下选择数出若干个小格中的细菌数目，（一般数125个小格），根据比例关系折算出单位体积菌液中细菌的数量。
血球计数板规格：
计数格=4*4=16大格1大格=5*5=25小格
小格体积=0.05*0.05*0.1=0.00025mm3=2.5*10-7ml（长*宽*高）
计算方法例如：
125格中90个细菌，则（90÷125）÷（2.5*10-7）个/ml=2.88*106所以，125格中的细菌大约在31（4格1个菌）—3125（每个小格25个菌）个。
2.2.3诱变处理及接种
①将紫外灯打开，预热30min；
②取无菌培养皿（Φ90mm，含无菌大针），加入稀释好的菌悬液8ml以覆盖培养
皿底面为宜。
③将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，开启磁力搅拌仪旋纽进行搅
拌1分钟，然后打开皿盖，分别处理10s、20s、40s、80s、160s（可以累积照射），照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯；
④每个照射剂量分别取0.5ml分别稀释1000倍和100倍，然后取稀释液0.1ml
做普通培养基的涂布培养，每个处理两个重复；同时每个照射剂量取0.1ml照射液直接做两个筛选培养基的涂布培养。
⑤对照涂布培养：
将照射的菌液稀释1000倍，在稀释液中取0.1ml做2个普通培
养基涂布培养，2个筛选培养基的涂布培养。
涂布要均匀，培养基表面无液流。
⑥37℃培养24h后，计数，统计分析。
对于筛选的抗性菌种进行验证、纯化。
2.2.4.结果计数、分析、统计及讨论
①以辐射时间为横坐标，以存活菌落数的lg值为纵坐标，作紫外线对大肠杆菌致死效应曲线。
②列公式计算不同辐射剂量下的致死率。
死亡率?
照射前活菌数/ml?
照射后活菌数/ml
?
100%
照射前活菌数/ml
③计算并比较不同辐射剂量下大肠管杆菌的抗药突变率，并分析不同辐射剂量的诱变效果差异原因
突变率=筛选平板菌数/普通平板菌数*100%④抗药性菌株的筛选与纯化
将一抗性克隆划线到一新的抗性平板上，与对照菌相比较，观察生长状况
3.结果与分析
3.1实验结果记录及初步整理
表1.大肠杆菌诱变初始数据
照射时间
010204080160
筛选培养基活菌数
个/皿
1号2号平均00000000000
00000000000
00000000000
普通培养下稀释度
10010-210-310-210-310-210-310-210-310-210-3
普通培养基中菌数
个/皿
1号2号平均5000XX3662522054000
56001820251640500000
5300182025144.51302.52000
溶液浓度个/ml5.3*1071.8*1062.5*1064.5*1041*1043.5*10302.5*1032*10500
3.2最佳照射时间的设置
结合数据处理结果的图和表分析，在10s的照射下，细菌死亡率达到了95%，20s时达到了99.9%，说明在20s内大部分菌株已经死亡，而整个实验过程中未发生任何正突变，可能与此有较大关系。
已经有实验证实，当菌种死亡率达到70%~80%时，突变率最大。
所以在做进一步的实验中应该减少照射剂量，或通过增多10s内的照射设置，或增大照射距离，因为时间太短可能导致控制实验的难度加大。
使死亡率变化曲线能突显出变化趋势。
3.3筛选培养基选择
筛选培养基是将发生突变的菌株从普通菌株中显现出来并对其浓缩。
该实验中的筛选培养基中的添加剂是硫酸卡那霉素，若发生突变的菌株能对其显现出抗性，但这抗性也是有一定范围的，若超过其抗性范围即使发生突变也不能正常生长。
本实验选用的50mg/L,实验证明该浓度对于该菌种抗性选育来说已经过高，应该选择较低的浓度。
可以在试验前对该菌种的最低致死浓度做检测。
将制备好的出发菌株溶液涂布在含不同浓度硫酸卡那霉素的平板上,37℃培养24h,观察不同平板上的菌落数,并记录不同抗生素作用浓度。
凡是在前一个低浓度平板上已长出菌落而在后一个较高浓度平板上未长出菌落的,后一浓度即为某种抗生素对出发菌株的最低致死浓度【1】。
表2.不同照射剂量下的存活率lg值和死亡率照射时间/s010204080160
存活菌浓度5.3*1072.5*1064.5*1043.5*1032.5*1030
存活菌的lg值7.726.404.653.543.39
死亡菌浓度0
5.05*1075.29*1075.299*1075.299*1075.3*107
致死率00.9530.9990.99（本文来自：
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大肠菌群实验报告）990.99991
4.小结与讨论
（1）本实验通过对大肠杆菌进行紫外线照射，欲得到抗性菌株，但由于照射剂量过大和抗生素浓度过高等原因未得到任何一株抗性菌株。
（2）通过本实验，得到了在28cm，下大肠杆菌的照射致死致死曲线，可以依此曲线反回归在该照射条件下选择合适的照射时间得到较高的突变率。
（3）欲得到较高的抗性突变率，还可尝试改变培养温度，有实验证实不同的温度培养会对细菌的突变率造成影响【2】。
（4）欲得到较好的突变率还需要较优质的菌株。
因为菌株的突变主要是发生在遗传物质复制转录的过程中，所以菌株的生理活性对突变效率会有很大影响，最好选择在对数期的菌株。
状况比较同步、易变异、重复性较好；同时为了保证处理时具有一定的细胞浓度,以增加可变异细胞总数,故选用对数期的细胞进行处理。
[1]涂国全,刘姝,黎循航.通过获得链霉菌抗性基因突变株筛选梅岭霉素高产菌株[J].中国抗生素,XX,27（6）:
321-325.
[2]汪志芸抗生素产生菌AP19-1的鉴定及UV诱变育种的研究[D],浙江：
浙江大学生命科学学院，XX，29
篇三：
微生物实验报告：
水中细菌总数和大肠菌群的检测
实验六水中细菌总数和大肠菌群的检测
摘要：
本实验以测定公园河流水的细菌总数和大肠菌群的数量，来测定特定地点的水质情况。
初步介绍了一种通用的方法来检测水源的健康指标，判定水体的质量。
对该实验点的水源作出了定性的评价，以及关于试验中如何提高梯度重复的精度的分析。
关键字：
河流水；细菌总数测定；大肠菌群；EMB培养前言
各种天然水中常含有一定数量的微生物。
水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关，因而是评价水质污染程度的重要指标之一。
细菌总数是指1mL水样中所含细菌菌落的总数[cfu/g（mL）]，可用稀释平板计数法检测。
水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。
特征：
G-无芽孢杆菌，兼性厌氧、在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气。
多管发酵法
初发酵：
适当稀释样品，乳糖发酵培养，产酸产气；
分离培养：
伊红美蓝（EMB）平板上划线分离，出现紫色、粉红色特征性菌落；复发酵验证：
挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。
材料和方法
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：
用于水中细菌总数测定
牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5.0g，琼脂8g，蒸馏水1000ml；pH7.0乳糖胆盐蛋白胨培养基：
用于初发酵
1×：
蛋白胨20g、牛胆盐5g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL（调pH值后加）、水1000mL、pH7.2－7.4三倍浓缩液（3×）：
除水以外，其余成分取三倍用量
分装：
1×的培养基分装9ml/管，3×的培养基分装5ml/管或50ml/瓶，均装上德汉氏小管。
灭菌条件：
115℃，15min。
EMB培养基：
用于大肠菌群菌落鉴定
脱水培养基，按说明书操作，水用量为90%。
水源：
紫竹院河水
仪器：
高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。
试剂：
牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂粉，伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0.04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂
具体实验步骤：
1），相关器械的灭菌操作，以及前往紫竹院取少量的样品水。
2），按照上述的配料，无菌操作配置培养基。
-1-2-3
3），细菌总数的测定：
取上述样品水，一次稀释10,10,10,3个浓度。
对于每个浓度，取1ml稀释液加入冷却好的牛肉膏蛋白胨培养基中，立即混匀，每个浓度重复一次。
将平皿倒置培养在37℃的温箱24h，计算平皿的细菌总数。
4），大肠菌群的测定：
将样品水稀释成10,10,10,3个梯度。
实验结果与数据分析1，细菌菌落总数
稀释浓度及菌落数
组别12平均
101248
0-1-2
10000
10000
平板菌落状况报告方式选取最低稀释度下菌落数×稀释倍数
菌落总数（cfug,cfu/ml
均小于30
8.0×10
2,大肠菌群总数
实验结果产酸产气紫黑色
EMB
粉红色
革兰-G氏染
色
结论阳性管数初发酵
+++
原溶液++++++
+++
+++
++++
+
+
+++
5
+
-0
10
10
ck-----
3，EMB数据值计算查表可得，MPN=MPN指数?
10ml
接种量最大的一管的水样ml
接种量最大的管：
1ml
每100ml水样中菌数最大可能值：
230
95%可信限值上限：
700下限：
70水样的分析得出这样的结果：
细菌总数：
80个/mL
大肠菌群数：
2300个/L
大肠菌群数占细菌总数：
2.88%。
根据我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85规定细菌总数不超过100个，已达标。
大肠菌群不得超过1000个，超标。
经过严格的消毒处理，大肠杆菌不超过10000个，水样达标。
结论：
从上述的水样分析，我们可以得出此处的河流水污染不是很严重，作为景观水，已经达到了标准，但是此类水是不能作为饮用水的，可能存在一些粪便的污染，导致大肠菌群的数量过高，倘若经过严格的消毒灭菌，才能饮用。
实验讨论：
1，大肠菌群的定义是什么？
、为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：
需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
而由于大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。
大量的调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，而且人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。
粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
所以大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
2，EMB培养基含有哪几种主要成分？
在检查大肠菌群时，各起什么作用？
EMB培养基主要包含以下几种物质：
蛋白胨，乳糖，蔗糖，磷酸二氢钾，伊红Y，美蓝，蒸馏水。
EMB培养基的机制就是靠微生物在发酵过程中，使培养基发生分解，产生大量的氢离子，从而改变培养基的PH，由于提前添加的指示剂，在PH值的改变下，就会发生颜色的变化，从而鉴定生长的菌种。
在检测大肠菌群的时候，蛋白胨提供了氮源，磷酸二氢钾提供了磷元素和钾元素，
实验应注意的问题以及改进：
1，样品的问题
由于本实验是一个检测的实验，存在一个严格灭菌的过程。
从采样，到最后的分析，整个过程不仅不能让其他杂菌污染，而且还得保证样品中本身细菌的总数基本不损失。
1），采样的器械必须是经过严格灭菌的，而且其本身的构造不会对微生物的生存造成威胁。
2），由于样品会处于密闭的过程，水中的含氧量会慢慢降低，所以对样品的处理应该尽快处理。
3），对于样品的稀释不应该用蒸馏水，而应该用灭菌的生理盐水，防止细菌吸水裂解死亡。
4），整个接种的操作必须正确，不能杀死细菌，或者引入其他杂菌。
2，关于梯度重复的问题
本实验设计到一个很关键的问题，那就是梯度重复。
对于一个梯度的实验量的统计和处理，我们常常采用重复，来解决其实验误差所造成的影响，但有些时候重复增加了大量的工作量，却没有根本提高实验的准确性，仅以本实验为例。
在对细菌数量测定时候，我们每
个梯度设置了2个重复，在事实上，第一个梯度的准确性很高，但是在最后一个梯度，可能存在很大的误差。
在对一个样品进行定量分析的时候，我们往往要考虑很多干扰它的因数。
假定我们所取的样品现在要进行一个梯度的稀释后取样，当前浓度为c，取样的体积为v，那么假定单位体积内只存在一个细菌，则可以建立如下的数学模型：
w?
?
x
n
i
?
x
nx
ai
x?
cv,
xi?
x?
aip,ai?
p?
kcvcv
cv?
?
k?
a?
?
i?
?
?
vc?
n?
从模型中，我们可以得到最终的表达式：
w?
ai?
nvc
ai
?
vc?
?
，当取样体
积和梯度恒定的时候，我们不难发现，增大取样的重复数，可以提高实验的精确度，但是当c足够大的时候，分子本身就会变得无限小，而分母的一次增量远不如多次的。
同理，当c很小的时候，分子变得很大，分母变得很小，这个时候不增加次数，或者调解取样体积，会造成很高的实验误差，所以，本实验的三个精度变量就是梯度，取样体积，梯度重复数。
鉴于对本实验的最后分析，我们觉得，在后两个梯度有必要增加重复数，虽然增加了工作量，但是可以有效避免较大的实验误差带来的干扰。
同样，在对其他的实验样品处理过程中，原始浓度一般只需要2个重复，随着数量级的增加，其重复的次数也应该发生变化，不应该不
-3-5
变，诸如在在10，设置4个重复，而10时候，可以设置8个重复，这样可以在追求最简工作量的时候，获得最简的实验结果。
参考文献：
[1]王玉兰.环境微生物学实验方法与技术.北京，化学工业出版社.XX,3.[2]陈坚.环境微生物实验技术.北京：
化学工业出版社，XX
[3]钱存柔.微生物学实验教程（第二版）.北京：
北京大学出版社，XX[4]周德庆.微生物学教程（第二版）.北京：
高等教育出版社，XX,5.[5]沈萍.微生物学.北京：
高等教育出版社，XX.
[6]徐全智，杨晋浩.数学建模（第二版）.北京：
高等教育出版社，XX.
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