整理动物布鲁氏菌病诊断技术GB.docx

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整理动物布鲁氏菌病诊断技术GB

动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T18646—2002

1　范围

本标准规定了动物布鲁氏菌病的诊断技术。

本标准规定的虎红平板凝集试验、乳牛全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病的监测及诊断泌乳母牛布病的初筛试验；试管凝集试验和补体结合试验适用于诊断羊种、牛种和猪种布病感染的家畜。

本标准规定的试管凝集试验不适用于犬种和绵羊副睾种布病感染家畜的检疫。

2　虎红平板凝集试验

2.1　材料准备

2.1.1　抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。

2.1.2　受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。

2.1.3　洁净的玻璃板，其上划分成4cm2的方格。

2.1.4　吸管或分装器，适于滴加0.03mL。

2.1.5　牙签或火柴杆，供搅拌用。

2.2　操作方法

2.2.1　将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清0.03mL。

2.2.2　在受检血清旁滴加抗原0.03mL。

2.2.3　用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。

2.2.4　每次试验应设阴、阳性血清对照。

2.3　判定

2.3.1　在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。

2.3.2　受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性（—）。

3　乳牛布病全乳环状试验

3.1　材料准备

3.1.1　布病全乳环状抗原

由制标单位提供，按说明书使用。

3.1.2　乳样

3.1.2.1　受检乳样须为新鲜的全乳。

3.1.2.2　采乳样时应将母畜的乳房用温水洗净、擦干，然后将乳液挤入洁净的器皿中。

3.1.2.3　采集的乳样夏季时应于当日内检查；保存于2℃时，7d内仍可使用。

3.2　操作方法

3.2.1　取乳样lml，加于灭菌凝集试验管内。

3.2.2　取充分振荡混合均匀的全乳环状抗原1滴（约50ul）加人乳样中充分混匀。

3.2.3　置37℃一38℃水浴中60min。

3.2.4　加温后取出试管勿使振荡，立即进行判定。

3.3　判定

标准分为：

a）强阳性反应（+++），乳柱上层乳脂形成明显红色的环带，乳柱白色，临界分明；

b）阳性反应（++），乳脂层的环带呈红色，但不显著，乳柱略带颜色；

c）弱阳性反应（+），乳脂层的环带颜色较浅，但比乳柱颜色略深；

d）疑似反应（±），乳脂层的环带颜色不明显，与乳柱分界不清，乳柱不褪色；

e）阴性反应（—），乳柱上层无任何变化，乳柱颜色均匀。

4　动物布病试管凝集试验

4.1　材料准备

4.1.1　稀释液

0.5%石炭酸生理盐水。

检验羊血清时用含0.5%石炭酸的10%盐溶液，如果血清稀释用含0.5%石炭酸的10%盐溶液，抗原的稀释应用含0.5%石炭酸的10%盐溶液。

4.1.2　抗原、阳性血清和阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。

4.1.3　凝集试验管（三分管）、试管架、吸管及温箱。

4.2　操作方法

4.2.1　按常规方法采血分离血清。

4.2.2　运送和保存血清样品时防止冻结和受热，以免影响凝集价。

若3d内不能送到实验室，按每9mL血清加1ml5%石炭酸生理盐水（徐徐加入）防腐，也可用冷藏方法运送血清。

4.2.3　受检血清的稀释

以羊和猪为例，每份血清用4支凝集试管。

4.2.3.1　第一管标记检验编码后加1.15mL稀释液。

4.2.3.2　第2—4管各加入0.5mL稀释液。

4.2.3.3　然后用1ml吸管取被检血清0.1mL；加入第1管内，并混合均匀。

混合方法是将该试管中的混合液吸人吸管内，再沿试管壁吹入试管中，如此吸入、吹出3—4次，充分混匀后以该吸管吸混合液0.25ml弃去，

4.2.3.4　取0.5mL混合液加入第2管，用该吸管如前述方法混合。

4.2.3.5　再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去混匀液0.5mL。

4.2.3.6　稀释完毕，从第1至第4管的血清稀释度分别为1：

125、1：

25、1：

50和1：

100。

4.2.3.7　牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致，差异是第一管加1.2mL稀释液和0.05mL被检血清。

4.2.3.8　将0.5mL20倍稀释的抗原加入已稀释好的各血清管中，并振摇均匀，羊和猪的血清稀释则依次变为1：

25、1：

50、1：

100和1：

200，牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为1：

50、1：

100、1：

200和1：

400。

大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、鹿、骆驼用1：

50和1：

100，猪、山羊、绵羊和狗用1：

25和1：

50。

4.2.3.9　置37℃—40℃温箱24h，取出检查并记录结果。

4.2.3.10　每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，即

a）阴性血清对照：

阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同。

b）阳性血清对照：

阳性血清须稀释到原有滴度，加抗原的方法与受检血清同。

c）抗原对照：

1：

20稀释抗原液0.5mL，再加0.5mL稀释液，观察抗原是否有自凝现象。

4.3　判定

4.3.1　供判定参照比浊管制备方法见附录E（提示的附录）。

4.3.2　结果判定

4.3.2.1　凝集反应程度分为：

参照比浊管，按各试管上层液体清亮度判读

a）++++菌体完全凝集，100％下沉，上层液体100％清亮；

b）+++菌体几乎完全凝集，上层液体75％清亮；

c）十十菌体凝集显著，液体50％清亮；

d）+凝集物有沉淀，液体25％清亮；

e）—凝集物无沉淀，液体均匀混浊。

4.3.2.2　牛、马、鹿和骆驼1：

100血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗1：

50血清稀释，出现“++”以上凝集现象时，受检血清判定为阳性。

4.3.2.3　牛、马、鹿、骆驼1：

50血清稀释，猪、山羊、绵羊、狗1：

25血清稀释，出现“++”以上凝集现象时，受检血清判定为可疑反应。

可疑反应家畜经3周一4周后重检，如果仍为可疑，该牛、羊判为阳性。

猪和马经重检仍保持可疑水平，而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性患畜出现，该畜被判为阴性。

猪血清偶有非特异性反应，须结合流行病学调查判定，必要时应配合补体结合试验和鉴别诊断，排除耶森氏菌交叉凝集反应。

5　动物布病补体结合试验

5.1　材料准备

5.1.1稀释液：

0.85％生理盐水按常规方法配制。

5.1.2绵羊红细胞悬液：

采取成年公绵羊血，按常规方法脱纤、洗涤、离心，用稀释液洗涤3—4次，最后二次以2000r/min离心沉淀lOmin，取下沉的红细胞泥，以稀释液配制成2.5％红细胞悬液。

5.1.3 抗原、标准阳性血清、阴性血清、溶血素由制标单位提供，按说明书使用。

5.1.4 受检血清：

收集和处理见附录A（标准的附录）。

5.1.5 溶血素：

效价测定见附录B（标准的附录）。

5.1.6 补体：

采集及其效价测定方法见附录C（标准的附录）。

5.1.7 抗原：

效价测定见附录D（标准的附录）。

5.2　操作方法

5.1.7.1 将1：

10稀释经灭能（见附录A）的受检血清加入2支三分管内，每管0.5mL。

5.1.7.2 其中一管加工作量抗原0.5mL，另一管加稀释液0.5mL。

5.1.7.3 上述2管均加工作量补体，每管0.5mL，振荡混匀。

5.1.7.4 置37℃一38℃水浴20min，取出放于室温（22℃一25℃）。

5.1.7.5 每管各加2单位的溶血素0.5mL和2.5％红细胞悬液0.5mL。

充分振荡混匀。

5.1.7.6 再置37℃一38℃水浴20min，之后取出立即进行第一次判定。

5.1.7.7 每次试验需设阳性血清、阴性血清、抗原、溶血素和补体对照。

主试验各要素添加量和顺序如表1。

表1　布鲁氏菌病补体结合试验的主试验 mL

血清

被检血清

对照管

阳性血清

阴性血清

抗原

溶血素

补体

血清加入量

0.5

稀释液

0.5

1.5

抗原

0.5

1.0

工作量补体

0.5

37℃—38℃水浴20min

二单位溶血素

0.5

2．5％红细胞

（2）防护支出法0.5

C.可能造成较大环境影响的建设项目，应当编制环境影响报告书0.5

0.5

4.建设项目环境影响评价文件的分级审批0.5

（7）环境影响评价的结论。

0.5

（1）建设项目概况。

0.5

（2）疾病成本法与人力资本法0.5

0.5

2.辨识与分析危险、有害因素37℃—38℃水浴20min

判定结果举例

++++

（3）对环境影响很小、不需要进行环境影响评价的建设项目，填报环境影响登记表。

—

C.环境影响报告书++++

1）直接使用价值。

直接使用价值（DUV）是由环境资源对目前的生产或消费的直接贡献来决定的。

—

++++

5.3判定

5.1.7.8第一次判定，要求不加抗原的阳性血清对照管，不加或加抗原的阴性血清对照管，抗原对照管呈完全溶血反应。

5.1.7.9初判后静置12h作第二次判定，第二次判定时要求溶血素对照管，补体对照管呈完全抑制溶血。

5.1.7.10对照正确无误即可对受检血清进行判定，受检血清加抗原管的判定参照标准比色管记录结果。

标准比色管的制备方法见附录F（提示的附录）。

5.1.7.1判定标准：

0—40%溶血判为阳性反应；

50%一90%溶血判为可疑反应；

100%溶血判为阴性反应。

牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同。

附　录　A

（标准的附录）

受检血清的采集和处理

以常规方法采血和分离血清。

用稀释液（5.1.1）将血清作1：

10稀释，按表B1规定的水浴灭能。

表A1 各种被检动物血清的灭能温度和时间

血清类别

灭能温度/℃

灭能时间/min

羊

58—59

马

58—59

驴、骡

63—64

黄牛、水牛、猪

56—57

鹿、骆驼

附　录　B

（标准的附录）

溶血素效价测定

B1稀释溶血素

取0.2ml含等量甘油防腐的溶血素，加9.8mL稀释液配成1：

100的基础稀释液，按表B1方法作进一步稀释。

表B1 溶血素稀释法 ml

管号

1：

100稀释溶血素

0.2

0.1

稀释液

0.8

0.9

1.4

1.9

2.4

2.9

3.4

3.9

4.4

4.9

5.4

溶血素稀释倍数

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

B2 按表B2加入各成份，而后37℃—38℃水浴20min。

B3 溶血素效价

从水浴中取出，立即判定结果，用1：

20补体0.5mL，在37℃—38℃水浴20min，能使2.5%红细胞液0.5mL完全溶血的最小量溶血素为溶血素效价或称一单位溶血素。

以表B2为例，对照管均不溶血，1—6管完全溶血，测定溶血素效价为3000倍。

在主试验时溶血素的工作效价为滴定效价的倍量或称二单位溶血素，则工作效价为1500倍稀释。

效价测定后，2—3个月内可按此效价使用，不必重测。

表B2 溶血素效价测定表 ml

管号

对照管

溶血素

补体

稀释液

溶血素

稀释倍数

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

100

加入量

0.5

稀释液

1.0

1.5

2.0

20补体

0.5

2.5%红细胞

0.5

37℃—38℃水浴20min

结果（例）

— — — — — —

+ + ++ +++

++++

完全溶血

部分溶血

完全不溶血

附　录　C

（规范性附录）

补体采集及其效价测定

C.1　补体采集

选择健康豚鼠3—5只，于使用前一天早晨饲喂前或停食后6h从心脏采血，分离血清后混合保存于普通冰箱中，也可从兽医生物药品厂购买冻干补体，使用前加稀释液恢复原量后使用。

C.2　补体效价测定

每次补体结合试验，应于当日测定补体效价。

C.2.1　稀释补体并加各种成份

用稀释液配制1:

20稀释补体，按表C1加入各种成份后，前后经37℃—38℃20min水浴2次。

C.2.2　补体效价

经过2次水浴，在2单位溶血素存在情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而在阳性血清未加抗原及阴性血清无论有无抗原的试管发生完全溶血所需最小补体量，就是所测得的补体效价。

以表C1为例，第6管1：

20稀释的补体0.25mL即为一个补体单位。

表C1 补体效价测定 ML

管号

对照

1：

20补体加入量

0.10

0.13

0.16

0.19

0.22

0.25

0.28

0.31

0.34

0.37

0.5

稀释液加入量

0.40

0.37

0.34

0.31

0.28

0.25

0.22

0.19

0.16

0.13

1.5

2.0

工作量抗原加入量（不加抗原量加稀释液）

0.5

振荡均匀后置37℃—38℃水浴20min

二单位溶血素

0.5

2.5%红细胞悬液

0.5

振荡均匀后置37℃—38℃水浴20min

结果

阳性血清加抗原

++++

阳性血清不加抗原

++++

+++

—

阴性血清加抗原

+++

—

阴性血清不加抗原

+++

—

C.3　原补体使用时应稀释倍数的计算

原补体使用时应稀释倍数按式（C1）计算：

补体稀释倍数

原补体稀释倍数= ×使用时每管加入量（C1）

测得效价

以表C1为例，按公式计算 ×0.5=40倍。

0.25

即此例补体应作40倍稀释，每管加0.5Ml，即为一个补体单位。

考虑补体性质不稳定，操作过程中效价会降低，正式试验时使用浓度比补体效价要大10%左右，本例补体工作单位作1：

36稀释，每管使用0.5mL。

附　录　D

（规范性附录）

抗原效价测定

一般按照兽医制药厂产品说明书的效价使用。

在初次使用或过久等其他原因需要测定时按下述步骤进行。

D.1　须取用两份阳性血清（分别为强阳性和弱阳性血清）和一份阴性血清来测定抗原效价。

D.2　阴性血清和阳性血清稀释

用稀释液对阴性对照血清仅作1：

10稀释，阳性血清稀释成1：

10、1：

25、1：

50、1：

75和1：

100，5个稀释度。

D.3　稀释抗原

用稀释液将抗原稀释成1：

10、1：

50、1：

75、1：

100、1：

150、1：

200、1：

300、1：

400和1：

500等稀释度。

D.4　按表D1加入各种成份，并经37℃—38℃20min水浴2次。

表D1 布鲁氏菌补体结合抗原效价测定 ML

管号

对照

抗原

稀释倍数加入量

100

150

200

300

400

500

补体对照溶血素对照

0.5

各种血清稀释度加入量

0.5

工作量补体

0.5

37℃—38℃水浴20min

二单位溶血素

0.5

2.5%红细胞

0.5

37℃—38℃水浴20min

D.5　记录抗原测定结果

从水浴中取出反应管，观察溶血百分数，记录结果。

例举范例如表D2

表D2 布鲁氏菌补体结合抗原效价滴定结果（举例）

抗原稀释倍数

100

150

200

300

400

500

血清稀释倍数

100

D.6　抗原效价

抗原对阴性血清应完全溶血。

对两份阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价。

在正式试验时，抗原的稀释度应比测定的效价浓25%。

以表D2为例，其效价为1：

150，正式试验时按1：

112.5稀释使用。

附　录　E

（规范性附录）

试管凝集试验参照比浊管的制备

每次试验须配比浊管，作为判定凝集反应程度的依据，先将20倍稀释抗原用等量稀释液作对倍稀释，然后按表E1配制比浊管。

表E1参照比浊管的配制

管号

1：

40稀释抗原液ml

稀释液ml

清亮度%

记录标记

0.00

1.00

100

++++

0.25

0.75

+++

0.50

0.75

0.25

1.00

0.00

—

附　录　F

（规范性附录）

溶血程度的标准比色管的配制

配制方法如表F1，牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同。

表F1 标准比色管的配制方法及反应判定标准

溶血溶液/%

100

溶血溶液1）

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.5%红细胞液

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

稀释液

2.00

1.80

1.60

1.40

1.20

1.00

0.80

0.60

0.40

0.20

判定符号

+++

++++

+++

—

判定标准

阳性

可疑

阴性

1）试验中全溶血的试管内液体即为溶血溶液

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