Functional characterization of the Xcs and Xps type II.docx

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FunctionalcharacterizationoftheXcsandXpstypeII

植物病原细菌XcvII型分泌系统Xcs和Xps的功能特性研究

摘要

1、很多植物病原菌的II型分泌系统常分泌细胞壁降解酶进植物质外体。

2、在这，我们的分析表明植物病原菌Xcv的Xps-T2SS能促进病害和促进通过T3SS而进入植物细胞壁的效应蛋白的转移。

3、反而，Xcs-T2SS缺乏一个明显的毒性功能。

但是，个别的xcs基因能部分的补充同源基因xps突变体的功能，这表明它们编码T2SS的功能原件。

酶活性分析显示Xps系统促成蛋白酶和木聚糖酶的分泌。

我们发现毒性相关木聚糖酶XynC是Xps系统的底物。

但是，已知来至其它Xanthomonasspp.的T2S底物的同系物没有被Xcv的T2Ssystems分泌。

因此，不同的Xanthomonasspp.它们的T2Ssystems分泌的底物的特征似乎也有显著性的不同。

4、转录分析结果表明，Xcv菌株中的xps基因由T3Ssystem的关键调控子——HrpG和HrpX激活表达。

相反，xynC和胞外蛋白酶和木聚糖酶的活性受HrpG和HrpX的抑制。

这说明Xpssystem的组件和底物的调控是有区别的。

简介

具有毒性的革兰氏阴性植物致病菌——黄单胞杆菌，常常依靠蛋白分泌系统来对植物进行作用，例如像细菌的粘附，植物细胞壁的降解，营养的获取和抑制植物的防卫反应（Prestonetal.,2005；Bu¨ttner&Bonas,2010）。

通过定向和随机诱变的方法可以显示出Xanthomonasspecies（spp.）中几种蛋白分泌系统的毒性功能，包括typeII,typeIII,typeIVandtypeV分泌系统和它们同源的底物（Bonasetal.,1991;Rayetal.,2000;Yangetal.,2000;Qianetal.,2005;Heetal.,2007;Wangetal.,2008a;Dasetal.,2009）。

在我们的实验室，我们研究了胡椒和西红柿细菌性斑点病的病原菌——Xcv的毒性因子。

III分泌系统对病原菌在植物体内的定殖和将病原菌的效应蛋白转运进植物细胞液，干扰植物细胞的功能，例如植物的防卫反应，是至关重要的（Ghosh,2004;Gu¨rlebecketal.,2006;Zhou&Chai,2008）。

效应蛋白转移进植物细胞壁依赖于胞外的Hrp（hypersensitiveresponseandpathogenicity）纤毛，此纤毛与T3SS的跨膜装置有关，能够作为蛋白转运入植物细胞壁的桥梁（Bu¨ttner&Bonas,2002;Ghosh，2004）。

T3SS的组件由染色体hrp基因簇编码，当细菌进入植物或在某些基本培养基上培养的时候，hrp基因将变得异常活跃（Bu¨ttner&Bonas,2002）。

hrp基因的表达依赖于调控子HrpG，调控子HrpG在大多数情况下又取决于转录激活子HrpX——一个基因表达调控单元，包括调控效应基因和编码预测的胞外降解酶的基因（Wengelnik&Bonas,1996;Wengelniketal.,1996b;Noe¨letal.,2001）。

对于T2SS对Xcv的致病力所起的作用至今还没有被研究过。

通常，T2SS分泌毒素和降解酶，在细菌细胞膜内，降解酶是通过Sec或TAT系统转运的，并促进植物病原细菌的致病力（Sandkvist,2001;Cianciotto,2005;Jhaetal.,2005）。

蛋白质可以由12-15个组件组成的T2S装置转运到细菌膜外，这些组件与细菌内膜相联系或形成一种pseudopiluspseudopilus结构（效应蛋白可以在pseudopilus中进行装配）（Sandkvist,2001）。

pseudopiluspseudopilus结构连续的装配和拆卸在加上膜外分泌素可以促进T2S底物的形成。

依赖II型泌出通道运输的蛋白很有可能是由与膜内分泌装置有关的细胞质ATPase激发的（Chenetal.,2005;Shiueetal.,2006,2007）。

通过比较不同的Xanthomonasspp.,发现Xcv，Xcc，Xac能编码两种不同的T2SS组件，即Xps和Xcs系统。

相比之下，Xoo和Xoc只包含Xps系统（Luetal.,2008）。

关于Xcc和Xoo的Xps系统的毒性功能已经被报道（Dowetal.,1987;Rayetal.,2000;Sunetal.,2005）。

植物细胞壁是微生物入侵的一个物理屏障，人们认为T2S的底物可以降解植物细胞壁的成份。

这与假设的，它们在植物细胞壁中扮演降解的角色具有较好的一致性，Xcc和Xoo的T2SS分泌的纤维素酶、聚半乳糖醛酸酶、木聚糖酶能促进细菌的毒力（Rajeshwarietal.,2005;Huetal.,2007;Jhaetal.,2007;Wangetal.,2008a,b）。

有趣的是，实验证据表明植物细胞壁降解酶不仅仅助于细菌的入侵植物组织，同时激发防卫反应阻碍微生物的入侵（Ryan&Farmer,1991;Liuetal.,2005;Chisholmetal.,2006;Jones&Dangl,2006;Bittel&Robatzek,2007;Jhaetal.,2007）。

然而在自然侵染的过程中，基础的植物防御被细菌的T3SS转运进植物细胞的效应蛋白抑制了，表明T2SS和T3SS存在功能之间的相互作用（Keshavarzietal.,2004;Metzetal.,2005;Jhaetal.,2007;Zhou&Chai,2008;Bartetzkoetal.,2009）。

值得注意的是，来至Xanthomonasspp.的几个T2S的组件和底物展示出与T3S基因联合调控的特征（Furutanietal.,2004;Wangetal.,2008b;Yamazakietal.,2008）。

在这项研究中，我们的分析表明Xcv的Xps系统促进细菌的毒性功能和III型效应蛋白的转移。

没有观察到Xcs系统在毒性功能上扮演什么明显的角色，但是，xcs基因能部分的补偿失去的xps同源基因的功能。

我们推测Xps系统的毒性功能源于胞外蛋白酶和木聚糖酶的分泌。

我们发现与毒性功能相关的木聚糖酶XynC是Xps系统的底物，并提供了实验证明：

Xps系统的组件和底物受不同的调控机制调控。

材料与方法

细菌菌株和生长条件

本实验中用到的菌株和质粒如表一如示。

Escherichiacoli（大肠杆菌）细胞用LB培养基或Supermedium（Qiagen）于37℃培养，Xcv菌株用NYG（nutrient–yeast–glycerol）培养基于30℃培养（Danielsetal.,1984）或用补充了10mM的蔗糖和0.3%的络蛋白水解物的基本培养基A培养（Ausubeletal.,1996）。

用电击的方法将质粒导入大肠杆菌，用接合的方式将质粒导入Xcv，用pRK2013作为三亲融合的辅助质粒（Figurski&Helinski,1979）。

加入培养基的抗生素的终浓度为：

氨苄青霉素（Ap）100ugml-1，庆大霉素（Gm）15ugml-1，卡那霉素（Km）25ugml-1，利福平（Rif）100ugml-1，奇霉素（Sp）100ugml-1，四环素（Tc）10ugml-1。

植物材料和植物接种

将等位基因呈线状的胡椒植株ECW-10R和ECW-30R（Minsavageetal.,1990）置于25℃，相对湿度60%-70%，16h光照培养。

如果没有另做说明，用针孔注射器将加入1mMMgCl2终浓度为2×108CFUml-1的Xcv注射入胡椒叶片的细胞间隙。

在接种后的2-10天这一阶段记录下病害症状和HR症状。

为了使HR反应更加形象化，叶子用70%的酒精脱色。

菌株在植物体内的生长曲线按照Bonas等人描述的方法执行（Bonasetal.,1991）。

所有的实验至少重复2次。

酶活性分析

为了分析胞外蛋白酶和木聚糖酶的活性，将Xcv菌株的密度调至109CFUml-1于NYG琼脂平板上培养，平板中分别加入1%的脱脂牛奶（AppliChem）和0.1%的雷马素亮蓝（RBB）木聚糖（Sigma-Aldrich）,（Vroemenetal.,1995）。

为了检测纤维素酶和淀粉酶的活性，在平板中分别加入1%羧甲基纤维素（CMC;Sigma-Aldrich）和1%的淀粉（AppliChem）。

CMC平板用0.2%的刚果红（Sigma-Aldrich）溶液染色，用0.5MNaCl褪色（Goughetal.,1988）。

淀粉平板用卢戈氏溶液（0.4%碘化钾：

0.2%碘酒溶液）染色，用98%乙醇-丙酮（1:

1）褪色（Huetal.,1995）。

在琼脂平板中央挖个小孔，将细菌接种进小孔中。

将平板置于30℃培养1-2d，所有实验至少重复两次。

基因敲除结构的构建

分别敲除xcsD,xpsD,xcsE,xpsE,XCV4312andxynC，然后用Xcv菌株85-10的基因组DNA作为模板对线性区域进行PCR扩增，将扩增子与自杀质粒pOK1连接。

参照Huguet等人描述的染色体互换的方法将敲除结构导入Xcv的基因组（1998）。

克隆细节按要求而定。

引物序列列于表S1。

GoldenGate-兼容性表达载体pBRM和pBRM-P的构建

GoldenGate系统能用限制性捆绑反应，有效地将PCR一步克隆扩增子克隆进目的载体（Engleretal.,2008）。

这个系统依赖于II型分泌系统的限制性酶（例如，BsaI）来将DNA切除出酶切识别位点。

在本试验中使用的GoldenGate-兼容性表达载体pBRM和pBRM-P来源于pBBR1MCS-5（见表1）。

为了移除pBBR1MCS-5内的BsaI位点，分别用引物pBBR1-for⁄pBBR2-rev和pBBR3-for⁄pBBR4-rev扩增载体DNA，扩增得到的两个片段用BsaI酶进行一步限制性捆绑反应进行再捆绑。

因此产生的pBBR1mod1载体的内部缺乏BsaI位点，包含单个的EcoRI和HindIII位点从而能代替多聚接头。

为了构建pBRM，我们用引物lacZ-for⁄lacZ-rev从pUC19中扩增了lacZalpha基因，用引物myc-for⁄myc-rev从pC3003中扩增到三倍的c-Myc抗原决定簇-编码序列，然后克隆相对应片段（BpiI酶切）进pBBR1mod1的EcoRI/HindIII位点，即得到pBRM（图.S1）。

为了构建pBRM-P，我们用引物pBBR1-for和pBBR5-rev扩增pBRM，并用BsaI酶和连接酶对PCR反应产物进行一步限制性接合反应。

得到的载体pBBR1mod2缺少lac启动子，包含单个的EcoRI和HindIII位点从而能代替多聚接头。

我们用引物lacZprom-for和myc-Esp-rev从pBRM中扩增到了lac启动子、lacZ基因、c-Myc抗原决定簇-编码序列。

相应的PCR片段和pBRM分别用Esp3I和EcoRI/HindIII酶切，然后连接，因而得到pBRM-P（见图.S1）。

表达结构的产生

为了产生能编码T2SS的组件和假设底物的表达结构，我们从Xcv菌株85-10中扩增了相应的基因片段，并使用GATEWAY技术（英杰公司）将片段插入pENTR⁄D-TOPO和pDGW4M。

另一种是参照Engler等人（2008）的方法使用一步限制性-接合反应将PCR扩增子克隆进pBRM和pBRM-P。

对于含有BsaI位点的片段，使反应混合物热失活，然后加入连接酶于37℃培养20min（Engleretal.,2008）。

所有结构列于表一。

蛋白质的分析和分泌实验

为了分析细菌蛋白质在植物中的积累，将密度为109CFUml-1的细菌接种进感病胡椒植株ECW的叶片。

在接种6h后，从5片搁浅于1mMMgCl2的叶片中提取蛋白质。

为了分析II型分泌物在体外的情况，将细菌于NYG培养基中培养过夜，用新鲜的NYG培养基重新悬浮细菌密度至1.5×108CFUml-1，然后在30℃培养2h。

参照Rossier等人（1999）的方法，通过过滤将上层液从细菌细胞中分离出来，分泌的蛋白质用三氯醋酸沉淀。

用SDS-PAGE和免疫印迹技术分析等量的总细菌细胞提取物和上层液培养物。

我们使用了抗HrpF，AvrBs3，HrcJ,GroEL的多克隆抗体（Knoopetal.,1991;Rossieretal.,2000;Bu¨ttneretal.,2002;Stressgen），抗-c-Myc的单克隆抗体（Roche），抗-链霉素的单克隆抗体（IBAGmbH）.。

含辣根过氧化物酶-标签的抗-兔抗体和抗-鼠抗体被用来作为二级抗体，并通过加强的化学荧光法使抗体反应更为直观，视觉化（AmershamPharmaciaBiotech）。

RNA分析

用qRT-PCR对转录水平进行分析，细菌在NYG培养基中培养过夜，将吸光值（OD，600nm）调至0.2，然后在30℃培养4h。

RNA按Trizol-based试剂盒说明书提取，cDNA链用4.5ugRNA做模板用RevertAidHMinusFirstStrandcDNA-SynthesisKit（Fermentas）合成。

xcsE,xpsE,xpsFandxopC转录子分别用引物xcsE_RT-for⁄xcsE_RT-rev,xpsE_RT-for⁄xpsE_RT-rev,xpsF_RT-for⁄xpsF_RT-revandxopC_RT-for⁄xopC_RT-rev扩增得到。

用？

？

ngcDNA作为模板进行荧光定量PCR反应，PCR仪采用美国Bio-Rad伯乐iCyclerPCR仪，荧光染料采用SYBRGreen-basedPCRreactionmixture（ABsoluteQPCRSYBRGreenFluoresceinMix;ABgeneLimited）。

PCR反应细节如有需要可以提供。

为了对不同基因的转录水平进行比较分析，最有效的方法是将每一个PCR反应的模板进行系列稀释法描绘成标准曲线。

为确保扩增的特异性，对扩增子做了熔解曲线分析（DNA双链解离曲线分析）和1.5%的凝胶电泳分析。

转录水平由technicaltriplicates决定，至于在ABIuserbulletin2（AppliedBiosystems）上描述的cDNA数量的差异则可用16SrRNA结构表达的转录水平（引物:

16S_RT-for/16S_RT-rev）来解释。

结果

Xcv菌株85-10中xcs和xps基因的体外表达

Xcv菌株85-10的基因组序列分析表明：

xcs基因簇包含12个（xpsCtoxpsN）基因，xps基因簇包含11个（xpsDtoxpsN）基因（图.1a;Thiemeetal.,2005）。

为了研究xcs和xps基因的表达，我们将Xcv菌株85-10在复合NYG培养基上培养，并对其cDNA做了RT-PCR分析。

我们以cDNAs为模板，用特异性引物对预计的ATPase-编码基因xcsE和xpsE进行扩增，并得到了相一致的片段，表明xcsE和xpsE是表达的（图.1b）。

qRT-PCR分析证实了，xpsE的转录水平为c.76-fold,比xcsE的转录水平要高（数据没有列出）。

预计的分泌基因xpsD促进细菌的毒力

为了研究Xcs和Xps系统在菌株Xcv菌株85-10中可能起到的毒性功能，我们分别敲除了xcsD和xps基因，这俩个基因可能分别编码两种T2SS的膜外分泌物。

正如预期的那样，将菌株85-10接种到感病胡椒植株ECW的叶片上，能诱发形成水渍状病变。

用菌株85-10△xcsD和敲除了整个xcs基因簇的85-10△xcs接种，也观察到类似的症状，说明xcs基因与菌株毒力无明显的关系（数据没有列出；图.S2）。

相比之下，菌株85-10△xpsD使得病害症状减轻（图.1c）。

随着接种细菌密度（2×107CFUml-1；图.1c,d）的降低，这种效应更为明显。

xpsD突变体的表型可以由xpsD基因异位表达补充，说明病害症状的减轻是由敲除的基因xpsD引起的（图.1c）。

为了研究分泌素编码基因编码的蛋白的其余的功能，我们敲除了Xcv菌株85-10基因组的xpsD和xcsD基因。

xcsD基因与xpsD序列有28%的同源性。

值得注意的是：

双敲除突变体菌株85-10△xpsD△xcsD诱发的病害症状比单敲除突变体菌株85-10△xpsD的要轻。

相比之下，双敲除突变体菌株85-10△xpsD△xcsE诱发的病害症状与单敲除突变体菌株85-10△xpsD的类似。

这表明菌株85-10△xpsD△xcsD额外的毒性的降低是由于缺乏xcsD基因引起的。

因此我们得出结论，XcsD至少能部分地补充XpsD。

除了病害症状以外，我们还研究了野生型菌株和突变体菌株在感病胡椒植株ECW中的生长情况。

接种到植物体内7天后，菌株85-10△xcsD与菌株85-10的生长量类似，菌株85-10△xpsD的生长量为c.100-fold,比菌株85-10的生长量要小（图.1e）。

菌株85-10△xpsD△xcsD的生长量更低，与观察到的表型相一致（图.1e）。

我们推测单敲除和双敲除基因突变体在植物体内生长量的降低不是由一般的生长缺陷引起的，因为细菌在基本培养基上的生长不受影响。

缺乏预计T2S相关ATP酶的Xcv突变体的特性描述

为了要证实突变体分泌物的毒性表型是由没有功能的T2SS引起的，并且在膜外也不会发生改变，我们分别敲除了xcsE、xpsE、XCV4312。

XCV4312编码与预计的XcsE和XpsE有同源性的ATP酶，但在Xcv菌株85-10中位于xcs和xps基因簇之外。

xpsE基因的敲除引起了植物病害症状的显著减轻和细菌在植物体内生长量的下降（图.2a,b）。

在生长量变化上，菌株85-10△xpsE与菌株85-10△xpsD没什么区别；但菌株85-10△xpsE诱发的症状比菌株85-10△xpsD的要轻，推测xpsE与xpsD基因之间存在功能丰余性（图.2c、d,见上）。

相比之下，xcsE和XCV4312敲除突变体展示出野生型的表型（图.2a,数据没有列出）。

此外，菌株85-10△xpsE△xcsE激发的病害症状与菌株85-10△xpsE的相同（图.2a、c）。

但是，值得注意的是，菌株85-10△xpsE△xcsE较菌株85-10△xpsE，菌株85-10△xpsE△xcsE在植株体内的生长量进一步降低，表明在这方面XcsE（42%的序列与XpsE相一致）能部分地补充xpsE敲除突变体（图.2b）。

无论是单基因敲除突变体，还是双基因敲除突变体，其毒性的降低和在植物体内生长量的降低，都不是有一般的生长缺陷引起的，因为在基本培养基上，菌株的生长是不受影响的（图2e）。

xpsE突变体的表型能被xpsE或者是xpsE-c-myc的异位表达所补充，xpsE-c-myc为能编码C-末端c-Myc表位附加XpsE。

（图.2f）。

xpsE的缺失导致III型从属效应蛋白减少

除了研究病害症状，我们也研究了Xcv菌株的Xps和Xcs系统是否促进激发植物的防卫反应，并且探索这种防卫反应是否是由III型效应分子（也称为无毒蛋白【Avr】）激发抗性植物同源抗性（R）基因引起的。

Avr蛋白诱导的防卫反应常常和HR反应联系在一起，利用植物细胞的快速死亡限制细菌的繁殖（Dangl&Jones,2001）。

为了研究诱导的HR反应，我们将菌株85-10,85-10△xcs，85-10△xpsE接种到携带有Bs1抗性基因的胡椒植株ECW-10R的叶片中，菌株85-10可以传递III型效应分子AvrBs1激发植物的HR反应（Ronald&Staskawicz,1988;Escolaretal.,2001）。

菌株85-10中整个xcs基因的敲除不影响HR反应的诱发（数据没有显示）。

相比之下，菌株85-10△xpsE较菌株85-10，诱导的HR反应显著降低（图.3a）.我们接着测试了其它的III型效应蛋白的，包括AvrBs3、XopC、XopJ和XopF1，采用AvrBs3△2作为报告分子。

AvrBs3△2是III型效应蛋白AvrBs3的衍生物，缺乏分泌和转移信号。

但是，AvrBs3△2包含效应区域，当其与III型功能的分泌物和转移信号融合的时候，其能在抗性胡椒植株ECW-30R中被识别出（Szurek等人,2002;Noe¨l等人,2003）。

像预期的那样，菌株85-10能表达AvrBs31-200-,XopC1-200-,XopJ1-155-和XopF11-200-AvrBs3△2融合蛋白并诱导胡椒植株ECW-30R叶片产生HR反应（Szureketal.,2002;Noe¨letal.,2003;Bu¨ttneretal.,2007;图.3a）。

然而，由相应的xpsE敲除突变菌株诱导的HR反应减轻了，表明XpsE对转移效应蛋白来说是必须的（图.3a）。

为了研究转移效应蛋白的减少是否是由于T3S的减少引起的，我们在植株体外对菌株85-10hrpG*（85*）和菌株85*△xpsE做了T3S分析。

两种菌株都包含关键调控子HrpG结构性激活衍生物，因此在体外无诱导条件的情况下也能表达T3S基因（Wengelniketal.,1999）。

为了在体外条件下研究T3S，菌株85*和菌株85*△xpsE接种到分泌物培养基，并对总细胞提取物和上层液培养物做免疫印迹分析。

图.3b展示了相等量的T3S效应蛋白HrpF和被挑选做体外T3S分析的

效应融合蛋白XopJ1-155–AvrBs3△2、XopC1-200–AvrBs3△2，3种效应蛋白均能在两种菌株的上层液培养物中检测到。

结果表明，Xps系统对T3SS本身的活性来说不是必须的。

接着，我们研究了在接种后的哪个时间点可以检测到效应蛋白的减少。

为此，我们用奇霉素处理胡椒植株ECW-10R的叶片组织来封锁细菌蛋白质的合成。

在处理过奇霉素后的0-4h彻底摧毁了由菌株85-10和菌株85-10△xpsE诱导的HR反应（图.3c）。

但是，在奇霉素处理过后的6h，菌株85-10又诱导了HR反应，相反菌株85-10△xpsE没有诱导了HR反应（图.3c）。

这说明菌株85-10在6h内积累的转移效应蛋白的量可以激发HR反应，而菌株85-10△xpsE却不能。

而接种6h后HR反应的减弱不是由菌株量的不同引起的，图3d比较了菌株85-10和菌株85-10△xpsE的数量。

我们同样用免疫印迹分析了6h内Hrp和效应蛋白的积累。

当细菌进入到植物质外体的时候，hrp基因的表达被特异性的激发了，我们推测这是由于植物衍生的分子引起的（Schulte&Bonas,1992;Wengelniketal.,1996a