陈映珊 要写的毕业设计.docx
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陈映珊要写的毕业设计
钦州 学 院
本科毕业论文（设计）
胃蛋白酶法提取鲈鱼鱼鳞
胶原蛋白的工艺研究
院系海洋学院
专业海洋科学（生物制药）
学生班级2008级2班
姓名陈映珊
学号0811403223
指导教师单位海洋学院
指导教师姓名张艳秋
指导教师职称讲师
胃蛋白酶法提取鲈鱼鱼鳞胶原蛋白的工艺研究
摘要：
本论文以新鲜鱼鳞为原料，以胃蛋白酶,在酸性条件下对鱼鳞中胶原蛋白进行提取,测定脱钙后的鱼鳞溶液在最大吸收波长的吸光度值，通过单因素（酶用量、反应时间、温度和pH）实验和L9（34）正交实验，得到提取鲈鱼鱼鳞胶原蛋白的最佳工艺。
结果表明：
果皮天然色素溶液最大吸收波长为538nm，最佳提取条件为：
实验研究目的是为生产上鱼鳞胶原蛋白提供技术参考。
关键字：
鱼鳞胶原蛋白脱钙胃蛋白酶
英文版
目录
1前言3
1.1胶原蛋白概述3
1.2鲈鱼的概述5
2材料和方法5
2.1材料和仪器5
2.1.1实验材料5
2.1.2使用仪器5
2.2所用试剂6
2.2.1试剂配制6
2.3试验方法7
2.3.1鱼鳞的预处理7
2.3.2EDTA脱钙7
2.3.3氯化钠脱除杂蛋白8
2.3.4凯氏定氮法测定蛋白质含量（GB/T5009.5—2010）8
2.3.5胃蛋白酶提取胶原蛋白10
3结果与分析12
3.1EDTA微波脱钙正交试验的极差分析结果12
3.2钙占鱼鳞干重百分比13
3.3酶法提取胶原蛋白13
4讨论14
致谢15
参考文献16
1前言
1.1胶原蛋白概述
胶原蛋白是一种生物性高分子物质，英文学名Collagen。
优质的胶原蛋白的特点为：
胶原蛋白本不易溶于水，粉状的胶原蛋白提取物，经过低温酶降解技术，将分子量结构降低后，溶水性才会变好，在温水中能帮助其溶解。
此外，纯正的胶原蛋白提取物有股淡淡的腥味，类似于鱼腥和豆粉的味道，添加了调味剂的除外。
并且胶原蛋白提取物溶解在水中会出现透明的淡黄色，因为胶原蛋白少数分子与水中的氢分子产生反应，成为氯基酸的一种。
胶原蛋白对人体器官的正常生理功能的调节起着举足轻重的作用，某些疾病与胶原蛋白发生的病变有着内在的联系[1,2]人体骨骼是由1／3有机物和2／3无机物组成的，其中有机成份的80％一-,90％是I型胶原蛋白[3]胶原蛋白起着维持骨结构的完整和骨生物力学的作用，人体要有足够的胶原蛋白来形成关节软骨，来润滑关节，否则易造成关节炎的发生，人到老年时合成胶原蛋白能力降低导致骨质疏松等病，患有骨质疏松症者的前交叉韧带中胶原蛋白含量比正常人低[4]。
人体皮肤中含有Ⅳ型胶原蛋白，它分布在组织内部连接表皮和真皮。
XV型胶原蛋白分布于血管、神经组织的外围地带，与角化细胞肿瘤黑色素细胞肿瘤发生有关，Ⅸ型胶原蛋白影响人体听力，而且对II型胶原蛋白的结构也有一定的影响[5]。
当胶原蛋白不足时，不仅皮肤及骨骼会出现问题，对内脏器官也会产生不利影响。
也就是说，胶原蛋白是维持身体正常活动所不可缺少的重要成分。
同时也是使身体保持年轻、防止老化的物质。
另外，胶原蛋白还可以预防疾病，改善体质，对美容和健康都很有帮助。
胶原蛋白（collagen）是一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质，它主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极其重要的结构蛋白质。
近几年来国内外对胶原蛋白的提取及纯化进行了大量研究，而从海洋生物中提取胶原蛋白目前主要集中在国外。
由于疯牛病，口蹄疫和禽流感等的影响，人们开始以鱼皮、鱿鱼、海参等海洋生物材料[6,7,8]作为提取胶原蛋白的新原料。
胶原蛋白具有特殊的结构与功能，并具有广泛的用途，胶原蛋白的开发和利用，目前已经成为人们关注和研究的热点。
随着生物和高分子科学的不断发展，人们会对此有更深的了解和认识。
在食品、美容化妆品、生物医学材料、其他工业中的应用，如造纸工业、制革工业、日用化学工业等轻工业中的应用。
本研究选用胃蛋白酶,在酸性条件下进行胶原蛋白的提取,分别通过混合均匀设计和正交实验设计法,主要研究了加酶量、底物浓度和提取时间三个因素对提取效果的影响。
1.2鲈鱼的概述
鲈鱼（weever），又称花鲈、寨花、鲈板、四肋鱼等，俗称鲈鲛，与长江鲥鱼、太湖银鱼并称为“四大名鱼”之一。
鲈鱼肉质白嫩、清香，没有腥味，肉为蒜瓣形，最宜清蒸、红烧或炖汤。
鲈鱼分布于太平洋西部、中国沿海及通海的淡水水体中均产之，黄海、渤海较多。
为常见的经济鱼类之一，也是发展海水养殖的品种。
其生态环境为：
近岸浅海中下层鱼类，常栖息于河口咸淡水处，也可生活于淡水中春夏间幼鱼有成群溯河习性，冬季返归海中主食鱼、虾类。
秋末冬初在河口产卵。
卵浮性，径1.35～1.44mm，具油球。
化学成分有：
食部100g，含水分78g，蛋白质17.5g，脂肪3.1g，碳水化物0.4g，灰分lg；钙56mg，磷131mg，铁1.2mg，核黄素（riboflavine）0.23mg，烟酸（nicotinicacid）1.7mg。
台湾产者含水分76.10%，粗蛋白19.39%，粗脂肪1.16%，灰分1.16%。
关于维生素，：
100g中有维生素A18Ou，B1130μg、B2110μg，烟素2.4mg。
其功能主治：
益脾胃；补肝肾。
主脾虚泻痢；消化不良；疳积；百日咳；水肿；筋骨萎弱，胎动不安；疮疡久不愈。
2材料和方法
2.1材料和仪器
2.1.1实验材料
市场上新鲜鱼鳞；胃蛋白酶。
2.1.2使用仪器
微波炉；722型分光光度计；定氮蒸馏装置；FW-100高速万能粉碎机：
上海胜启仪器仪表有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：
金坛市科析仪器有限公司；FA2004电子天平：
上海上天精密仪器有限公司；80-1电动离心机：
上海梅香仪器有限公司
2.2所用试剂
EDTA胶钙液（0.025、0.05、0.075、0.10、0.15、0.25mL/L）；
氨水缓冲液（pH=10）；铬黑T指示剂；
标准锌溶液；氯化钠（3%）溶液；
硫酸铜（CuSO4•5H2O）；硫酸钾（K2SO4）；
硫酸（H2SO4密度为1.84g/L）；硼酸（H3BO3）；
甲基红指示剂（C15H15N3O2）；溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）；
亚甲基蓝指示剂（C16H18CIN3S•3H2O）硼酸溶液（20g/L）
氢氧化钠溶液（400g/L）甲基红乙醇溶液（1g/L）
硫酸标准滴定溶（0.0500mol/L）或盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）；
亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）
混合指示剂
2.2.1试剂配制
2.2.1.1EDTA胶钙液（0.025、0.05、0.075、0.10、0.15、0.25mL/L）：
0.05mol/LEDTA的配置（中国药典2010版二部附录179）：
取乙二胺四醋酸二钠19g,加适量的水使溶解成1000ml，摇匀。
同上，可配置0.025、0.075、0.10、0.15、0.20、0.25mol/L的EDTA溶液。
2.2.1.20.05mol/L标准锌溶液配置：
取硫酸锌15g（相当于锌约3.3g）,加稀盐酸10ml与水适量使溶解成1000ml,摇匀。
标定：
精密量取本液25ml,加0.025%甲基红的乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液呈为黄色，加水25ml,氨-氯化铵缓冲液（pH10.0）10ml与铬黑T指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液由紫色变为纯蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。
根据乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05mol/L）的消耗量，算出本液的浓度，即得。
2.2.1.3混合指示液：
2份甲基红乙醇溶液（4.13）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（4.14）临用混合。
也可用1份甲基红乙醇溶液（4.13）与5份溴甲酚绿乙醇溶液（4.15）临用时混合。
2.3试验方法
2.3.1鱼鳞的预处理
新鲜鱼鳞清水洗净，晾干，用0.1mol/LHCl浸泡3d，用蒸馏水洗净，干燥箱36℃干燥，装袋冰柜中冷冻备用。
2.3.2EDTA脱钙
2.3.2.1MW—EDTA快速胶钙方法[9,10]
称取鱼鳞2g，放入100mL4℃预冷的EDTA胶钙液中，再将装有鱼鳞的EDTA胶钙液的三角瓶放入盛有500mL冰水的大烧杯内，然后放入微波炉；分别用不用微波功率胶钙，并纪录时间和测三角瓶中胶钙液的温度，定时向大烧杯中添加冰块，使胶钙液温度始终控制在40℃以内，防止温度升高引起组织软化，造成胶原蛋白的流失。
[11,12]
2.3.2.2取样以及测定[13]
准确称取鱼鳞各2g，分别放入100mL0.025、0.05、0.075、0.10、0.15、0.20、0.25mol/L的EDTA溶液中，不时摇动，取样，每次取1mLEDTA脱钙液，再加入99mL蒸馏水、5mL氨水缓冲液（pH=10）和一滴铬黑T指示剂，摇匀，以0.05mol/L标准锌溶液滴定，当指示剂的颜色由蓝色变为紫色时，滴定结束，测得滴定的体积为V1。
取1mL该浓度的EDTA溶液，按上述方法进行空白试验，测得滴定的体积V0。
计算钙占鱼鳞干重百分比：
Ca2+%=（V1-V0）×Czn2+×40×V×10-3×100/W×100
V0：
滴定空白EDTA溶液消耗的标准锌体积数（Ml）;
V1：
滴定EDTA脱钙液消耗的标准锌体积数（Ml）;
Czn2+：
标准锌溶液的摩尔浓度（mol/L）;
V：
脱钙液或消化液总体积（Ml）；
W：
鱼鳞的干重（g）=鱼鳞的质量（g）×（1-鱼鳞的水分%）。
2.3.2.3EDTA微波脱钙正交试验
表1EDTA微波脱钙正交试验因素水平表
水平
因素
A
B
C
微波功率/W
EDTA/mol/L
时间/min
1
255
0.15
20
2
425
0.20
30
3
595
0.25
40
2.3.3氯化钠脱除杂蛋白
取脱钙后的鱼鳞（1g），利用氯化钠（3%）溶液来除去其中的盐溶性和水溶性杂蛋白。
抽滤，蒸馏水清洗。
2.3.4凯氏定氮法测定蛋白质含量（GB/T5009.5—2010）
2.3.4.1式样处理：
称取充分混匀的固体试样0.2g~2g,半固体试样2g~5g或液体试样10g~25g（约相当于30mg~40mg氮），精确至0.001g，移入干燥的100mL，250mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜（4.1）、6g硫酸钾（4.2）及20mL硫酸（4.3），轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45o角斜支于有小孔的石棉网上。
小心加热，待内容物全部碳化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5h~1h。
取下放冷，小心加入20mL水。
放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用，同时做世纪空白试验。
2.3.4.2测定
按图1装好定氮蒸馏装置，想水蒸气发生器内装水至2、3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液（4.13）数滴及数毫升硫酸（4.3），以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。
2.3.4.3向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液（4.10）及1滴～2混合指示液（4.16），并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0mL~10.0mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以10mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。
将10.0mL氢氧化钠溶液（4.11）倒入小玻杯，担起玻塞使其缓缓注入反应室，立
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