水产品中孔雀石绿测定.docx

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水产品中孔雀石绿测定

XXX实验室检测中心

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作业指导书

（第A版第0次修改）

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水产品中孔雀石绿的测定

第A版第0次修改

颁布日期：

2014年月日

1.目的

使孔雀石绿的测定处于受控状态，保证孔雀石绿检测结果的准确性与一致性；规范参加本项目检测工作人员的操作规程。

2.适用范围

本作业指导书规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的酶联免疫测定方法。

本作业指导书适用于鱼、虾以及鱼池或者鱼缸水样中的总的孔雀石绿残留量的检测。

3.引用依据

孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒使用说明书。

水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的快速筛选测定酶联免疫法DB34/T1421-2011

水产品中孔雀石绿和结品紫及其代谢产物的快速测定方法SN/T1768-2006

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法GB/T20361-2006

4.概述

孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，既是杀真菌剂，又是染料。

长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。

研究显示，孔雀石绿在鱼体内残留时间长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。

5.酶联免疫吸附法

5.1.原理

本孔雀石绿类酶联免疫检验试剂，主要是利用还原剂将样品中的孔雀石绿还原成隐性孔雀石绿后，利用抗原与抗体之特异性免疫化学反应的基本原理来进行的，换句话说，就是利用酶标记物与样品中之隐性孔雀石绿对微孔中之抗体来进行竞争反应。

在整个反应当中，如果样品中之隐性孔雀石绿残留的越多，相对地就会竞争掉越多的抗体，使得结合了与微孔盘上包被的抗原结合抗体的二次抗体相对地就会减少。

因此，反应中之酶标记物结合体-底物溶液之呈色就会很淡，甚至几乎没有颜色，此即为阳性反应。

反之，若样品中没有含隐性孔雀石绿，则呈色会比较深，与阴性标准品呈色几乎是一样的，此即为阴性反应。

5.2.试剂和材料

5.2.1.实验室用试剂：

所用试剂除另有规定外，均为分析纯。

水为符合GB/T6682规定的二级水。

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2014年月日

5.2.2.乙酸乙酯。

5.2.3.正己烷。

5.2.4.12N盐酸溶液

5.2.5.孔雀石绿酶联免疫试剂盒

5.3.仪器和设备

5.3.1.酶标仪：

配备450nm滤光片。

5.3.2.分析天平：

感量0.001g，感量0.0001g。

5.3.3.恒温培养箱。

5.3.4.均质器。

5.3.5.旋涡振荡器。

5.3.6.离心机：

离心力≥4000g。

5.3.7.氮吹仪

5.3.8.微量单道/多道移液器：

10μL～100μL；100μL～1000μL；50μL～300μL。

5.3.9.水浴锅。

5.3.10.聚四氟乙烯离心管：

5mL，50mL，具塞。

5.4.样品处理

5.4.1.将2克已均质之样品放入15mL离心管中，加入0.4%还原剂3mL后立刻震荡1分钟使成肉浆状。

5.4.2.静置30分钟。

5.4.3.再加入6盐酸-乙酸乙酯，震荡1分钟。

5.4.4.以离心机离心1700×g（约3500rpm）10分钟。

5.4.5.离心后若于上层有机层内观察到白色胶状物时，用竹棒或移液枪头搅拌上层有机层后再次以1700×g（约3500rpm）离心10分钟。

5.4.6.取3mL上层液（盐酸-乙酸乙酯）至10mL玻璃管中，于60℃下，利用氮气将有机溶剂吹干。

5.4.7.于此玻璃管中加入正己烷1mL,剧烈震荡将残余物完全溶解（若氮吹后的管内有很多油脂时，可将正己烷加入量改为2mL。

）。

5.4.8.缓缓加入1mL样品稀释液，轻柔混合震荡（vortex）1分钟。

5.4.9.以离心机离心1700×g（约3500rpm）10分钟。

5.4.10.若离心后不能确实分层而在两层问出现乳化层时，请置于沸水中隔水加热至上下确实分

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层，待玻璃管冷却至室温后再次以离心机离心1700×g（约3500rpm）10分钟。

用吸管吸去上层液（正己烷），再吸取下层液（水层）备用

稀释倍数：

1

5.5.酶联免疫测定

5.5.1.使用前将试剂盒置于室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2-8℃不要冷冻;

5.5.2.于适当微孔分别加入100μL隐性孔雀石绿标准液。

5.5.3.在另外的微孔加入100μL已完成前处理之样品溶液。

5.5.4.再于每一微孔另再加入100μL的1倍隐性孔雀石绿抗体。

5.5.5.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应30分钟。

5.5.6.将微孔中之反应液甩掉，再将300μL的1倍清洗液加满每一微孔后甩掉，重复此步骤洗3次。

5.5.7.最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。

5.5.8.于每一微孔加入100μL的1倍二次抗体。

5.5.9.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应30分钟。

5.5.10.将微孔中之反应液甩掉，再将300μL的1倍清洗液加满每一微孔后甩掉，重复此步骤洗3次。

5.5.11.最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。

5.5.12.于每一微孔加入底物溶液100μL。

5.5.13.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温卜反应20分钟。

5.5.14.加入反应终止液，每一微孔加入100μL。

5.5.15.酶标仪以单波长450nm或双波长450nm/650nm判读。

5.6.结果判定

5.6.1.定性判定

用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含孔雀石绿浓度范围（ng/ml）。

假设样品1的吸光度值为0.313，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是:

0；；；；；0.6ppb为0.198。

则样品1的浓度范围0.3ppb-0.6ppb;样品2的浓度范围0.05ppb-0.lppb。

（再乘以相应的稀释倍数）

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5.6.2.定量判定

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（BO）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值。

BO—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值。

以标准品百分吸光率为纵坐标，以孔雀石绿标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。

将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中孔雀石绿的实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

5.7.方法的检出限、回收率、重复性

5.7.1.检出限

本方法孔雀石绿及其代谢残留物的检出限为μg/kg。

5.7.2.回收率

在样品中添加0.1μg/kg～4μg/kg浓度水平时，回收率为70％～120％。

5.7.3.重复性

本方法的批内变异系数≤10％，批间变异系数≤10％。

5.8.结果表述

当所对应的样品的测定值小于其检出限时，报告为孔雀石绿未检出。

当测定值大于检出限时，报告为孔雀石绿检出。

出现阳性值时（超过相关标准、规定的限量值），需用液相色谱-串联质谱法（LC/MS-MS）加以确证。

6.液相色谱法

6.1.原理

试样中的残留的孔雀石绿、结晶紫及其代谢物用孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取、浓缩后用液相色谱进行检测，外标法定量。

6.2.试剂和材料

除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。

6.2.1.乙腈:

色谱纯。

6.2.2.无水乙酸钠。

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6.2.3.冰乙酸:

色谱纯。

6.2.4.异丙醇。

6.2.5.对-甲苯磺酸。

6.2.6.乙酸盐缓冲液:

称取4.950g无水乙酸钠及0.950g对-甲苯磺酸，溶解于950mL水中，用冰乙酸调节溶液pH到4.5，最后用水定容到1000mL。

6.2.7.标准品:

孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫纯度大于98%。

6.2.8.标准贮备溶液:

准确称量孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫各10mg，用乙睛分别定容于100mL容量瓶中，配制成100μg/mL的标准贮备液。

6.2.9.混合标准溶液:

用流动相稀释标准贮备溶液，配制成孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为10μg/mL的混合标准溶液。

0℃～4℃避光保存。

6.2.10.孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒。

6.3.仪器和设备

6.3.1.高效液相色谱仪:

配紫外-可见光可变波长检测器；检测波长时间程序可控。

6.3.2.匀浆机。

6.3.3.旋转蒸发仪。

6.3.4.离心机:

4000r/min,8000r/min。

6.3.5.振荡器。

6.3.6.超声波水浴。

6.3.7.聚四氟乙烯离心管:

2.5mL,50mL，具塞。

6.3.8.微孔滤膜:

0.45μm。

6.4.测定步骤

6.4.1.提取、净化

准确称取已捣碎的样品5.00g于50mL离心管中，先加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中的提取剂（液体20.0mL）、用匀浆机以8OOOr/min的速度均质30s，再加入于鸡心瓶中再加入异丙醇10mL50℃～55℃水浴旋转蒸干。

残留物用1.0mL流动相溶解，溶解液放人2.5mL离心管中，8000r/min离心5min后，用微孔滤膜过滤，滤液供仪器测定。

6.4.2.绘制标准工作曲线

移取孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结品紫混合标准溶液，用流动相稀释成2ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL标准工作溶液，用高效液相色谱仪测定，得出标准工作曲线。

6.4.3.测定

6.4.3.1.液相色谱条件

a）色谱往:

C18柱，250mm×4.6mm（内径），粒度5μm；

b）流动相:

乙腈+乙酸盐缓冲液（80+20，体积分数）;

c）流速：

1.0mL/min；

d）柱温：

室温；

e）检测波长时间程序:

0min～5.0min,618nm;0min～12min,588nm;12min～18min,267nm;孔雀石绿的检测波长为618nm，结晶紫的检测波长为588nm,隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的检测波长为267nm。

f）进样量：

50μL。

6.4.3.2.色谱测定

根据样液中孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。

标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的响应值均应在仪器的检测线性范围内。

在上述色谱条件下，孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的保留时间约为孔雀石绿,隐色孔雀石绿13.6min、结晶紫和隐色结晶紫14.7min。

标准品色谱图参见附录A中图A.1。

6.4.4.空白实验

除不加试样外，按上述测定步骤进行。

6.5.结果计算

用色谱数据处理机或按下式分别计算供试样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。

式中:

w—水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；

ci—标准曲线上查出试样溶液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准工作溶液的浓度，单位为微克每升（μg/L）；

V—最终定容体积数，单位为毫升（mL）；

2—换算常数;

m—供试试料样品质量，单位为克（g）。

本方法分别计算孔雀石绿及代谢产物隐色孔雀石绿，并分别报告孔雀石绿及代谢产物隐色孔雀石绿结果。

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本方法分别计算结晶紫及代谢产物隐色结晶紫，并分别报告结晶紫及代谢产物隐色结晶紫结果。

6.6.检测限

本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为2.0μg/kg。

6.7.回收率

本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫回收率为:

85%～105%。

7.高效液相色谱荧光检测法

7.1.原理

样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐色孔雀石绿或隐色结晶紫，乙腈-乙酸铵缓冲混合液提取，二氯甲烷液液萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。

7.2.试剂

除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682一级水的标准。

7.2.1.乙腈:

色谱纯。

7.2.2.二氯甲烷。

7.2.3.酸性氧化铝:

分析纯，粒度0.071mm～0.150mm。

7.2.4.二甘醇。

7.2.5.硼氢化钾。

7.2.6.无水乙酸铵。

7.2.7.冰乙酸。

7.2.8.氨水。

7.2.9.硼氢化钾溶液[0.03mol/L]:

称取0.405g硼氢化钾于烧杯中，加250mL水溶解，现配现用。

7.2.10.硼氢化钾溶液mol/L]:

称取0.54g硼氢化钾于烧杯中，加50mL水溶解，现配现用。

7.2.11.20%盐酸羟胺溶液:

溶解g盐酸羟胺在50m水中。

7.2.12.对-甲苯磺酸溶液[/L]:

称取对-甲苯磺酸，用水稀释至100mL。

7.2.13.乙酸铵缓冲溶液mol/L]:

称取g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，氨水调pH到10.0。

7.2.14.乙酸铵缓冲溶液[mol/L]:

称取9.64g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH到4.5。

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7.2.15.酸性氧化铝固相萃取柱:

500mg，3mL。

使用前用5mL乙腈活化。

7.2.16.VarianPRS柱或相当者:

500mg,3mL。

使用前用5mL乙腈活化。

7.2.17.标准品:

孔雀石绿（MG）分子式为[（C23H25N2）（C2HO4）]2C2H2O4、结晶紫（GV）分子式为C25H29CIN3，纯度大于98%。

7.2.18.标准储备溶液:

准确称取适量的孔雀石绿、结晶紫标准品，用乙腈分别配制成100μg/mL的标准贮备液。

7.2.19.混合标准中间液（1μg/mL）:

分别准确吸取l.00mL孔雀石绿和结晶紫的标准储备溶液至100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成1μg/mL的混合标准中间溶液。

-18℃避光保存。

7.2.20.混合标准工作溶液:

根据需要，临用时准确吸取一定量的混合标准中间溶液，加人硼氢化钾溶液mL，用乙腈准确稀释至mL，配制适当浓度的混合标准工作液。

7.3.仪器与设备

7.3.1.高效液相色谱仪:

配荧光检测器。

7.3.2.匀浆机。

7.3.3.离心机:

4000r/min。

7.3.4.旋涡振荡器。

7.3.5.固相萃取装置。

7.3.6.旋转蒸发仪。

7.4.样品制备

7.4.1.取样

鱼去鳞、去皮，沿背脊取肌肉部分；虾去头、壳、肠腺，取肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食部分。

样品切为不大于cm的小块后混合。

7.4.2.提取

称取g样品于50mL离心管内，加入10mL乙腈,1000r/min匀浆提取30s，加入5g酸性氧化铝，振荡2min,4000r/min离心10min，上清液转移至125mL分液漏斗中，在分液漏斗中加入2mL二甘醇，3mL硼氢化钾溶液（7.2.10），振摇2min。

另取50mL离心管加入10mL乙腈，洗涤匀浆机刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，加入3mL硼氢化钾溶液（7.2.10），用玻棒捣散离心管中的沉淀并搅匀，漩涡混匀器上振荡1min，静置20min,4000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中。

在50mL离心管中继续加入mL盐酸羟胺溶液（7.2.11）,2.5mL对-甲苯磺酸溶液（）,缓冲溶液），振荡2min，再加入10mL乙腈，继续振荡2min，

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4000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中，重复上述操作一次。

在分液漏斗中加人20mL二氯甲烷，具塞，剧烈振摇2min，静置分层，将下层溶液转移至250mL茄形瓶中，继续在分液漏斗中加入5mL乙腈、10mL二氯甲烷，振摇2min，把全部溶液转移至50mL离心管，4000r/min离心10min，下层溶液合并至250mL茄形瓶，45℃旋转蒸发至近干，用mL乙腈溶解残渣。

7.4.3.净化

将PRS柱安装在固相萃取装置上，上端连接酸性氧化铝固相萃取柱，用5mL乙腈活化，转移提取液到柱上，再用乙腈洗茄形瓶两次，每次mL，依次过柱，弃去酸性氧化铝柱，吹PRS柱近干，在不抽真空的情况下，加入3mL等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液（7.2.13），收集洗脱液，乙腈定容至3mL，过m滤膜，供液相色谱测定。

7.5.测定

7.5.1.色谱条件

7.5.1.1.色谱柱:

ODS-C18柱，mm（内径），粒度5μm。

7.5.1.2.流动相:

乙腈+乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L,pH4.5）=80+2O。

7.5.1.3.流速in。

7.5.1.4.柱温：

35℃。

7.5.1.5.激发波长：

265nm。

7.5.1.6.发射波长：

360nm。

7.5.1.7.进样量:

20μL。

7.5.2.色谱分析

分别注入20μL孔雀石绿和结晶紫混合标准工作溶液及样品提取液于液相色谱仪中，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。

根据标准品的保留时间定性，外标法定量。

标准品色谱图参见附录A。

7.6.结果

7.6.1.计算

样品中孔雀石绿和结晶紫的残留量按下式计算：

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式中：

X—样品中待测组分残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

cs—待测组分标准工作液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

A—样品中待测组分的峰面积;

As—待测组分标准工作液的峰面积;

V—样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；

m—样品质量，单位为克（g）。

7.6.2.线性范围

孔雀石绿和结晶紫混合标准溶液的线性范围：

0.1ng/mL～600ng/mL。

7.6.3.检出限

本方法孔雀石绿、结晶紫的检出限均为0.5μg/kg。

7.6.4.回收率

在样品中添加g/kg～100μg/kg孔雀石绿时，回收率为70%～110%。

在样品中添加g/kg～100μg/kg结晶紫时，回收率为70%～110%。

7.6.5.重复性

本方法的相对标准偏差≤15%。

8.相关文件

孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒使用说明书

天平称量操作规程

高速离心机操作规程

氮吹仪操作规程

数显鼓风干燥箱操作规程

全自动洗板机操作规程

酶标仪操作规程

9.注意事项

9.1.样本处理步骤

（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

对用氮气吹干的管子要预先干燥。

（3）乙腈、二氯甲烷、正己烷均有一定毒性，使用前必须做好防护措施。

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（4）乙腈、二氯甲烷、正己烷均易挥发，所以每次加入试剂后均须盖好盖子。

（5）用枪加液时注意枪头是否松动，移液枪是否准确。

用排枪时注意各个枪头吸的液体是否一致，否则用手推紧枪头。

9.2.酶联免疫测定步骤

（1）室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃会导致所有标准的OD值偏低）。

（2）在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。

所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

（3）每加一种试剂前需要将其摇匀。

（4）反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

如不慎滴漏到皮肤上，请尽快用水冲洗。

（5）不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂；掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

（6）储存条件

保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。

标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

（7）试剂变质的迹象

显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。

0标准的吸光度（450nm）值小于0.6（A450nm<0.6）时，表示试剂可能变质。

（8）在加入显色剂后，一般显色15min即可。

若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过30min。

反之，则缩短反应时间。

（9）离心管用重铬酸钾洗液浸泡5分钟，再用自来水洗净可以去除可能残留的孔雀石绿的污染。

（10）该试剂盒最佳反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。