第十七节 血红蛋白的提取和分离二.docx

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第十七节血红蛋白的提取和分离二

血红蛋白的提取和分离

（二）

主讲：

黄冈中学优秀生物教师　王小敏

回顾上节课：

二、实验操作

阅读血液组成成分，思考：

1、血液由血浆和血细胞两部分组成。

2、血细胞中红细胞细胞数量最多，红细胞的含量最高的有机化合物是血红蛋白。

3、该化合物是由2条α-肽链和2条β-肽链构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的亚铁血红素基团。

（一）样品处理

本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。

思考1：

你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？

为什么？

　　　哺乳动物血液。

因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

1、红细胞的洗涤：

　　①洗涤目的：

是去除杂蛋白。

以利于后续血红蛋白的分离纯化。

　　②洗涤方法：

　　思考2：

加入柠檬酸钠有何目的？

为什么要低速、短时离心？

为什么要缓慢搅拌？

　　防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

2、血红蛋白的释放：

　　加蒸馏水到原血液体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟。

思考3：

加入的蒸馏水、甲苯的作用分别是什么？

充分搅拌的目的是什么？

　　　蒸馏水的作用：

使红细胞大量吸水胀裂。

　　　甲苯的作用：

溶解红细胞的细胞膜。

　　　充分搅拌的目的：

加速红细胞的破裂。

3、分离血红蛋白溶液：

（二）粗分离——透析

1、过程：

将血红蛋白溶液装入透析袋，置于磷酸缓冲液（pH为7.0）中，透析12小时。

　　在透析过程中，血红蛋白不能通过半透膜，而离子和小分子能够通过半透膜扩散进入磷酸缓冲液中。

2、透析目的：

除去样品中分子量较小的杂质。

（三）纯化——凝胶色谱操作

1、凝胶色谱柱的制作：

　　①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

　　②底塞的制作：

橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。

　　注意事项：

底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。

　　③顶塞的制作：

打孔→安装玻璃管。

　　④组装：

将上述三者按相应位置组装成一个整体。

⑤安装其他附属结构。

2、凝胶色谱柱的装填

　　装填材料：

交联葡聚糖凝胶（G-75）、20mmol/L磷酸缓冲液

　　“G”：

表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。

　　75：

表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。

步骤

操作要求

①

固定色谱柱

色谱柱垂直固定在支架上

②

计算称量凝胶

根据色谱柱体积计算凝胶用量

③

配制悬浮液

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀

或：

凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

④

装填悬浮液

一次性缓慢倒入；轻轻敲打

⑤

缓冲液洗涤平衡

立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h

注意事项：

　　①凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。

　　②装填凝胶柱时不得有气泡存在。

因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

　　③洗涤时，液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。

　　④不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

3、样品加入与洗脱

　　①调节缓冲液面：

打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

　　②滴加透析样品：

吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

　　③样品渗入凝胶床：

加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

　　④洗脱：

小心加入pH＝7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

　　⑤收集：

待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。

（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

注意事项：

　　正确的加样操作：

①不要触及并破坏凝胶面。

②贴壁加样。

③使吸管管口沿管壁环绕移动。

（四）纯度鉴定——聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定（略）

三、操作提示

1、红细胞的洗涤：

　　洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

2、色谱柱的装填：

　　装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

3、凝胶的预处理：

　　沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡

4、色谱柱成功标志：

红色区带均匀一致地移动。

四、结果分析与评价

1、你是否完成了对血液样品的处理？

你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？

　　观察你处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。

此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？

你的色谱柱装填得成功吗？

你是如何判断的？

　　由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。

此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。

如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。

如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？

请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？

　　如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

课堂小结：

-返回-

同步测试

一、选择题

1、凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（　）

A．对其他分子的亲和力　　　　　B．溶解度

C．所带电荷多少　　　　　　　　D．相对分子质量的大小

2、凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（　）

A．糖类化合物　　　　　　　　　B．脂质

C．蛋白质　　　　　　　　　　　D．核酸

3、选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处（　）

A．血红蛋白是有色蛋白　　　　　B．红细胞无细胞核

C．红细胞蛋白质含量高　　　　　D．红细胞DNA含量高

4、将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（　）

A．甲苯　　　　　　　　　　　　B．血红蛋白水溶液

C．脂溶性物质的沉淀层　　　　　D．其他杂质的沉淀

5、血红蛋白因含有（　）而呈红色。

A．O2　　　　　　　　　　　　　　　B．CO

C．CO2　　　　　　　　　　　　D．血红素

6、下列操作正确的是（　）

A．分离红细胞时采用低速长时间离心

B．红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可

C．分离血红蛋白溶液是低速短时间离心

D．透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h

7、样品的加入和洗脱的叙述正确的是（　）

A．先加入1ml透析后的样品

B．加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出

C．如果红色带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功

D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水

8、下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（　）

A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B．通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D．可通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

9、凝胶色谱法操作正确的是（　）

A．将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴

B．将橡皮塞下部切出凹穴

C．插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面

D．将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片

10、样品的加入和洗脱的操作不正确的是（　）

A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

DAADDDCBAD

二、非选择题

11、电泳利用了待分离样品中各种分子__________以及__________、__________的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。

显示答案

　　11、带电性质的差

异；分子本身的大小；形状的不同

12、下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入（图Ⅰ）和洗脱（图Ⅱ）示意图，请据图回答下列问题。

（1）在加样示意图中，正确的加样顺序是__________。

（2）用吸管加样时，应注意正确操作，分别是①__________　　　②__________　　　③__________

　　（3）等样品__________时，才加入缓冲液。

　　（4）待__________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每__________mL收集一管，连续收集。

显示答案

　　12、

（1）④→①→②→③

（2）不要触及破坏凝胶面　　贴着管壁加样　　使吸管管口沿管壁环绕移动

　　（3）完全进入凝胶层

　　（4）红色的蛋白质　5

13、血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2、CO2的运输。

请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。

（1）将实验流程补充完整：

A为__________，B为__________。

凝胶色谱法的基本原理是根据__________来分离不同种类的蛋白质。

（2）洗涤红细胞的目的是去除__________。

洗涤干净的标志是__________。

释放血红蛋白的过程中起作用的是_________。

　　（3）透析的作用是____________________。

显示答案

　　13、

（1）血红蛋白的释放　　样品的加入和洗脱　　相对分子质量的大小

（2）去除杂蛋白，利于后续步骤的纯化上清液中没有黄色蒸馏水和甲苯

　　（3）去除小分子杂质

-END-

课外拓展

电泳

（1）根据说明书安装电泳用的玻璃板。

（2）配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液。

用去离子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris缓冲液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的过硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5cm），再在胶液面上小心注入一层水（约高2～3mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。

　　（3）分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。

　　（4）配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。

用去离子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris缓冲液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的过硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。

整个操作过程应注意避免气泡的产生。

然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。

　　（5）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理。

在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100℃温度下加热3min，以使蛋白质变性。

　　（6）浓缩胶聚合完全后（30min），小心移出梳子。

把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。

必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。

　　（7）按顺序加