动物免疫学实验指导.docx

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动物免疫学实验指导

第二版

徐春厚谢为天雍艳红编

动物医学生物技术专业用

广东海洋大学教材科出版

二00七年二月二十八日

实验一凝集试验………………………………………………………1

实验二沉淀试验………………………………………………………4

实验三溶血试验………………………………………………………8

实验四病毒的血凝及血凝抑制试验………………………………10

实验五E-玫瑰花环试验……………………………………………13

实验六EA玫瑰花环试验……………………………………………15

实验七EAC玫瑰花环试验……………………………………………17

实验八酶联免疫吸附试验…………………………………………18

实验九荧光抗体技术………………………………………………20

实验十多克隆抗体（免疫血清）的制备…………………………22

实验一凝集试验

颗粒性抗原（细菌、螺旋体、红细胞等）与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应（Agglutinationreaction）或凝集试验。

参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。

细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。

抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。

根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。

凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。

[目的要求]

1.掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。

2.掌握凝集试验的结果判定及判定标准。

3.熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。

[材料与试剂]

1.玻板，载玻片，试管（1cmx8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。

2.灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。

3.布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。

4.鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。

[实验内容及操作方法]

（一）试管凝集试验

以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。

1.试管准备：

每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。

如被检血清有多份，对照只需做1份。

2.被检血清稀释：

第1管加入2.3ml0.5%石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5ml0.5%石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2ml，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5ml弃之，再吸取0.5ml加入第2管中，混匀后吸取0.5ml加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5ml（见表1-1）。

该被检血清的稀释度分别是1:

12.5、1:

25、1:

50、1:

100。

3.对照管制作：

第5管中加0.5%石炭酸生理盐水0.5ml，第6管加1:

25稀释的布氏杆菌病阳性血清0.5ml，第7管加1:

25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5ml。

4.加抗原：

将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5%石炭酸生理盐水作1:

20稀释，每支试管加0.5ml。

表1-1布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：

ml）

试管号

对照管

最终血清稀释度

1：

100

1：

200

抗原

阳性血清

阴性血清

1：

0.5%石炭酸生理盐水

2.3

0.5

被检血清

0.2

0.5

抗原（1：

20）

0.5

弃1.5弃0.5

5.感作（反应）：

7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24h取出），然后观察并记录结果。

6.结果判定：

判定结果时用“+”表示反应的强度。

根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。

＋＋＋＋：

100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。

＋＋＋：

75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。

（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。

＋＋：

50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。

＋：

25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。

－：

抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。

7.判定标准：

能使50%抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。

牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:

100，判为阳性，1:

50的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:

50，判为阳性，1:

25的凝集价判为疑似反应（可疑）。

[注意事项]

1.实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。

2.结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。

阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。

对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。

（二）布氏杆菌病平板凝集试验

1.加血清：

取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm2），并注明被检血清号码，以100L微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l格80L、第2格40L、第3格20L、第4格10L。

血清用前需放室温，使其温度达20℃左右。

每一份检样需换一个tip头。

大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40L和20L；猪、山羊、绵羊、狗用80L和40L。

2.加抗原：

每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30L，滴在血清附近，而不与血清接触。

从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。

抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20℃左右。

3.作用：

混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃左右，3-5min内记录反应结果。

4.对照：

每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。

5.结果判定：

按下列标准记录反应结果。

＋＋＋＋：

出现大的凝集块，液体完全透明，即100%凝集。

＋＋＋：

有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75%凝集。

＋＋：

有可见凝集块，液体不甚透明，即50%凝集。

＋：

液体混浊，有小的颗粒状物，即25%凝集。

－：

液体均匀混浊，无凝集现象。

6.平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表1-2。

表1-2平板凝集试验与试管凝集试验的关系

平板凝集

80L

40L

20L

10L

相当于试管凝集

100

200

7.判定标准：

同试管凝集试验。

8.注意：

对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。

（三）虎红平板凝集试验

这种试验是快速平板凝集试验。

抗原是布氏杆菌加虎红制成。

虎红平板凝集试验可与试管凝集试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。

1.被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30L滴于玻璃板的方格内，每份血清各用一支牙签或火柴棒混合均匀。

在室温（20℃）4-10min内记录反应结果。

同时以阳、阴性血清作对照。

2.结果判定：

在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。

3.注意：

抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。

（四）鸡白痢平板凝集试验

1.被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30L）滴于玻板或载玻片上，用牙签或火柴棒充分混合。

2.结果判定：

在室温（20℃）下，观察30-60s，凝集者为阳性，不凝集者为阴性。

[思考题]

1.凝集反应的原理是什么?

2.哪些因素影响细菌凝集试验?

3.凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？

实验二沉淀试验

可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、病毒、血清以及其他来源的蛋白质、多糖、类脂等）与其相应的抗体结合后，在电解质参与下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀反应（Precipitationreaction）。

沉淀反应中的抗原称为沉淀原（Precipitinogen），抗体称为沉淀素（Precipitin）。

沉淀反应主要包括有环状沉淀试验、琼脂扩散沉淀试验及免疫电泳等。

[目的要求]

1.掌握炭疽环状沉淀试验的操作方法和结果观察。

2.掌握琼脂扩散沉淀试验的原理和操作方法。

3.了解对流免疫电泳的—般原理和操作技术。

[材料与试剂]

1.口径0.4cm的小试管，毛细滴管，载玻片，平皿，烧杯没，打孔器，针头，酒精灯，加样器（移液器），滴头，电泳槽，电泳仪等。

2.生理盐水，8.5%NaCl溶液，0.5%石炭酸生理盐水，巴比妥缓冲液，琼脂粉等。

3.炭疽沉淀抗原（炭疽标准抗原），炭疽沉淀素血清，待检抗原。

4.禽流感琼扩抗原，禽流感阳性血清，待检鸡血清；兔抗猪IgG，猪血清，鸡血清，兔血清、牛血清，羊血清等。

5.小鹅瘟琼扩抗原，小鹅瘟抗血清；鸡传染性法氏囊病琼扩抗原（或待检法氏囊组织浸提液），鸡传染性法氏囊病阳性血清。

[实验内容及操作方法]

（一）环状沉淀试验

环状沉淀试验（Ringprecipitationtest）是最早的沉淀反应。

目前在链球菌的分类、鉴定，昆虫吸血性能及所吸血液来自何种动物的鉴别，肉品种属鉴定及炭疽尸体与皮张的检验工作中仍然应用。

以炭疽环状沉淀反应为例，此反应又称Ascoli氏反应。

1.待检抗原的制备

（1）取疑为炭疽死亡动物的实质脏器1g放入小烧杯中剪碎，加生理盐水5-10ml，煮沸30min，冷却后用滤纸过滤使之呈清澈透明的液体，即为待检抗原。

（2）如待检材料是皮张、兽毛等，可采用冷浸法。

先将样品高压灭菌30min后，皮张剪为小块并称重，加5-10倍的0.5%石炭酸生理盐水，置室温浸泡10-24h。

用滤纸过滤2-3次，使之呈清朗的液体，此即为待检抗原。

2.加样：

取3支口径0.4cm的小试管，在其底部各加约0.1ml的炭疽沉淀素血清（用毛细滴管加，注意液面勿有气泡）。

取其1支，用毛细滴管将待检抗原沿着管壁轻轻加入使重叠在炭疽沉淀素血清之上，上下两液间有一整齐的界面，注意勿产生气泡。

另2支小试管，一支加炭疽沉淀抗原，另一支加生理盐水，方法同上，作为对照。

3.结果判定：

5-10min内判定结果，上下重叠两液界面上出现乳白色环者，为炭疽阳性。

对照组中，加炭疽沉淀抗原者应出现白环，而加生理盐水者应不出现白环。

4.注意：

观察结果时，可将一只手放在小试管对测的适当位置上遮挡光线，有利于看到白色沉淀环。

（二）琼脂扩散沉淀试验

琼脂扩散沉淀试验（Agargelprecipitationtest，AGPT）是沉淀反应的一种形式。

物质自由运动形成扩散现象，扩散可以在各种介质中进行。

1%琼脂凝胶形成网状构架，空隙中是98%-99%的水，允许分子量在200ku以下分子通过。

绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在200ku以下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。

二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处结合成复合物，此复合物因颗粒较大而不能扩散，故形成沉淀带。

本试验可用已知抗体检测样品中的抗原，也可用已知抗原检测血清样品中的抗体。

1.琼脂板制备：

称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水或8.5%NaCl溶液（禽类），煮沸使之溶解。

待溶解的琼脂温度降至60℃左右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。

2.打孔：

用打孔器在琼脂凝胶板上按7孔梅花图案打孔，孔径约3-5mm，中心孔和周围孔间的距离约为3-5mm。

挑出孔内琼脂凝胶，注意不要挑破孔的边缘。

3.封底：

在火焰上缓缓加热，使孔底琼脂凝胶微微融化，以防止孔底边缘渗漏。

4.加样：

以毛细滴管（或加样器）将样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。

（1）血清流行病学调查：

将禽流感琼扩抗原置中心孔，周围1、3、5孔加禽流感阳性血清，2、4、6孔分别加待检鸡血清，每加一个样品应换一个滴头。

（2）抗血清效价测定：

将猪血清（抗原）加入中心孔，将兔抗猪IgG（抗体）作2倍比稀释，即l:

2、1:

4、1:

8、l:

16、1:

32等，分别加至周围孔中。

或者是将小鹅瘟琼扩抗原加入中心孔，周围孔加入l:

2、1:

4、1:

8、l:

16、1:

32等稀释的小鹅瘟抗血清。

（3）抗原检测：

将兔抗猪IgG（抗血清）加入中心孔，将待测抗原（猪血清、鸡血清、兔血清、牛血清、羊血清等）置于周围孔中。

或者是将鸡传染性法氏囊病阳性血清加入中心孔，周围孔加鸡传染性法氏囊病琼扩抗原（或待检法氏囊组织浸提液）。

5.感作：

将琼脂凝胶板加盖保湿，置于37℃温箱，24-48h后，判定结果。

6.结果判定

（1）血清流行病学调查：

待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性。

待检血清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带完全交叉者判为阴性。

（2）抗血清效价测定：

以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为抗血清的AGP效价。

（3）抗原检测：

兔抗猪IgG与猪血清孔之间有明显沉淀带，与其他血清孔之间不形成沉淀带。

鸡传染性法氏囊病阳性血清与鸡传染性法氏囊病琼扩抗原孔之间出现沉淀带，如与待组织浸提液孔之间出现沉淀带，说明该法氏囊组织中有鸡传染性法氏囊病病毒抗原。

（三）对流免疫电泳

在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白带有微弱的负电荷，在电泳时，由于电渗作用的影响，抗体球蛋白反而向负极倒退。

而一般抗原蛋白质带负电荷，在电泳力的作用下向正极移动。

二者在两孔之间相遇，形成肉眼可见的白色沉淀线。

本法由于抗原抗体分子在电场作用下定向运动，限制了自由扩散，从而提高了敏感性，它较琼脂扩散试验敏感性高10-16倍，并可大大缩短沉淀线出现的时间，适用于快速诊断。

1.琼脂板制备：

用巴比妥缓冲液配制1%-1.5%琼脂凝胶板，厚度2-3mm。

2.打孔：

孔径3-5mm，孔距4-10mm，一张载玻片可打12个孔，挑去孔内琼脂，封底。

3.加样：

一对孔中，一孔加已知（或待测）抗原，另一孔加待测（或已知）抗体。

4.电泳：

在电泳槽内加入pH8.6的巴比妥缓冲液，将滤纸片放入缓冲液内浸湿搭桥。

将抗原孔置于负极端。

电压2.5-6V/cm，或电流强度3-5mA/cm，电泳时间为30-90min。

5.结果观察：

断电后，将凝胶板置于灯光下，衬以黑色背景观察。

阳性者则在抗原与抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。

如沉淀线不清晰，可将琼脂凝胶板放在湿盒中37℃数小时或置电泳槽过夜再观察。

[思考题]

1.进行环状沉淀试验时，注意事项是什么？

2.琼脂扩散沉淀试验的操作方法及其应用。

3.对流免疫电泳的原理是什么？

实验三溶血试验

红细胞与其相应的抗体（溶血素）发生特异性结合，当加入补体时，抗原抗体复合物通过经典途径使补体活化，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应。

羊红细胞或鸡细胞+免疫血清（溶血素）+豚鼠血清（补体）→溶血反应。

补体（Complement）是存在于正常人和脊椎动物血清及组织液中一组具有酶原活性的蛋白质，以豚鼠血清中的补体成分较全且活性高。

由于补体对热敏感，56℃30min即被灭活，室温放置很快失活，0-10℃其活性仅能保持3-4d，实验时可以采用新鲜的豚鼠血清。

[目的要求]

1.通过溶血试验，掌握抗原、抗体与补体的关系及作用特点，理解和验证补体被激活后的溶细胞作用。

2.掌握溶血试验的操作与观察结果的方法。

[材料与试剂]

1.试管，试管架，可调加样器，滴头，滴管，注射器，针头等。

2.灭菌生理盐水，2%山羊红细胞悬液，兔抗山羊红细胞抗体（溶血素），2%鸡红细胞悬液，兔抗鸡红细胞抗体（溶血素），豚鼠血清。

[实验内容及操作方法]

1.2%山羊（或鸡）红细胞悬液的制备：

无菌取山羊（或鸡）抗凝血，离心去血浆，沉淀用生理盐水洗涤3次，每次2000r/min，离心10min，然后去掉上清液，血细胞泥用生理盐水配成2%的红细胞悬液。

2.溶血素的制备：

将免疫血清（溶血素）用生理盐水稀释成2单位（1:

500-1:

1000），56℃水浴30min灭活。

3.补体的制备：

将新鲜豚鼠血清（补体）用生理盐水稀释成1:

20，取1ml置56℃水浴30min灭活。

4.取小试管5支，依次编号。

按表3-1加入各成分，摇匀，置37℃水浴30min。

5.结果观察：

若管底无红细胞沉淀，上层液体红色透明者为完全溶血。

若液体呈混浊或放置后管底有红细胞沉淀为不溶血。

表3-1溶血试验（单位：

ml）

试管号

溶血素对照

补体对照

盐水对照

补、溶对照

2%红细胞

0.5

溶血素

0.5

—

0.5

补体

0.5

—

0.5

—

0.5*

生理盐水

—

0.5

1.0

—

结果

溶血

不溶血

注：

*56℃30min灭活的补体。

[思考题]

1.溶血试验中，第2、3、4、5管是什么对照？

为什么要设这些对照？

2.溶血试验的原理是什么？

实验四病毒的血凝及血凝抑制试验

有些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集（HA）试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制（HI）试验，具有特异性。

通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

[目的要求]

掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。

[材料与试剂]

1.96孔“U”形或“V”形微量反应板，50L定量移液器，滴头，微型振荡器。

2.生理盐水，0.5%鸡红细胞悬液。

3.新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。

[实验内容及操作方法]

（一）血球凝集（HA）试验

1.在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L生理盐水。

2.于左侧第1孔加50L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50L；第12孔为红细胞对照。

3.自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。

表4-1病毒血凝试验的操作方法（单位：

L）

孔号

病毒稀释度

128

256

512

1024

2048

对照

生理盐水

病毒液

0.5%红细胞

弃50

结果观察

++++

+++

4.结果判定：

从静置后10min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。

红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。

以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。

从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:

128，则l:

128为1个血凝单位，1:

64、l:

32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:

32稀释的病毒液为4个血凝单位。

（二）血球凝集抑制（HI）试验

1.根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。

2.在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50L生理盐水。

3.第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50L，稀释度分别为：

２、1:

4、1:

8……；第12孔加新城疫阳性血清50L，作为血清对照。

4.自第1孔至12孔各加50L4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min。

5.自第l孔至12孔各加0.5%鸡红细胞悬液50L，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。

表4-2病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：

L）

孔号

血清稀释度

128

256

512

1024

病毒

对照

血清

对照

生理盐水

被检鸡血清

4单位病毒

室温中静置10min

0.5%红细胞

弃去50

结果观察

+++

++++

6.结果判定：

待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。

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