DPPH和ABTSPTIO自由基清除试验操作图解李熙灿XicanLi.docx
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DPPH和ABTSPTIO自由基清除试验操作图解李熙灿XicanLi
DPPH?
和ABTS+?
自由基去除实验〔含PTIO?
自由基去除实验〕：
详细说明与疑难解答
李熙灿〔广州中医药大学中药学院,2021.7〕
〔以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li,X.,ComparativeStudyof1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazylRadical〔DPPH?
〕ScavengingCapacityofthe
AntioxidantXanthonesFamily.Chemistryselect,2021.3,13081-13086.[2]Li,X.;Ouyang,X.;Cai,R.;Chen,D.3-DimerizationEnha/8cestheAntioxidant
CapacityofFlavonoids:
EvidencefromAcacetinandIsoginkgetin.2021,Molecules.24,2039.[3]Li,X.C.,2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl
3-Oxide〔PTIO?
〕RadicalScavenging:
ANewandSimpleAntioxidantAssayInVitro.J.Agric.FoodChem.,2021.65,6288-6297
【概述】DPPH?
、ABTS+?
、PTIO?
自由基三者,都是常用的自由基.概述如下表:
DPPH?
自由基
ABTS+?
自由基
PTIO?
自由基
结构式
Q02K
NN-d^-NO2
0O2N
g/
.Q.*卡
简单表达式
DPPH
ABTS-+
PTIO-
分子式与分子量
Ci8H12N5O6;M.W.394.3
Ci8H24N6O6S;M.W.548.68
C13H17N2O2;M.W.233.3
带电情况
中性自由基
阳离子自由基
中性自由基
种类
氮自由基
〔成单电子在N原子上〕
氮自由基
〔成单电子在N原子上〕
氧自由基
〔成单电子在O原子上〕
外观
紫黑色粉末
没有名O勺ABTS•+
紫褐色粉末
溶解性与溶液颜色
溶于有机溶剂〔如甲醇、乙醇〕溶液呈紫色,浓度越高,颜色越深
溶于后机溶剂〔如甲醇、乙醇〕、水以及水
性的缓冲液
溶液呈墨绿色,浓度越高,颜色越深
溶于水以及水性的缓冲液
溶液呈蓝紫色,浓度越高,颜色越深
CAS号
1898-66-4
无
18390-00-6
工作液配制方法
将已购的DPPH自由基粉末,溶解即得其工作液
将已贝^的ABTS二钱盐［〔NH4〕2ABTS］与过一硫酸钾〔K2s2O8〕黑暗中反响12小时后,再稀释得其工作液.
将已购的PTIO自由基粉末,溶解即得其工作液
工作液紫外光谱与最大吸收
度光吸
3.0
2.5
0.5-
0.0H~I-|-~|_I_|_I~|-R-|_I_|_I~200300400500600700800900
波长/nm
557nm
检测波长
检测原理
用途
400®
O60
I00
8
0——
200
（0.07mM（NH4）2ABTS+0.03mMK2s2O8）
400600
波长/nm
（50g/mL）
800
519nm
当A519nm值减少,说明DPPH•被去除.
其去除机制主要是氢转移HAT
（hydrogenatomtransfer）
主要用于测试一个纯的化合物或者提取物,是否具有抗氧化活性或者活性的强弱.
734nm
当A734nm值减少,说明ABTS+被去除.其去除机制主要是电子转移ET（electron
transfer）主要用于测试一个纯的化合物或者提取物,是否具有抗氧化活性或者活性的强弱.
557nm（水溶液）
当A557减少,说明ABTS+被去除.
其清除机制主要是电子移ET（electron
transfer）加质子转移PT（protontransfer）
主要用于测试一个纯的化合物或者提取物,是
否具有抗氧化活性或者活性的强弱.
通过调节缓冲液的pH值,可以检测其抗氧化
机制.
优势
去除速度较快,约30分钟（室温下）.去除速度较快,约6分钟（室温下）
（1）水溶性好,与生物相关性强；
（2）是氧自由基,能更好地表往ROS去除水
平；
（3）抗氧化机制明确：
pH值小于5.0时,为电子转移ET机制.当调节pH值（如pH=5.0,6.0,7.4）时,其去除水平也随之改变,说明与pH值有关,也就是说与氢离子（质子）浓
度有美,据此,可证实其涉及PT机制.
局限性
〔1〕只能在后机溶剂〔如甲醇、乙醇〕中进行,不能在水溶液中进行；也不能在缓冲液中进行.
〔2〕其抗氧化活性,实际上是去除氮自由基的活性〔而不是氧自由基〕.
〔3〕虽然DPPH的去除主要是HAT抽制,但是在不同溶剂中,其抗氧化机制是不同的,还可能有ET等.
〔1〕不能在缓冲液中进行.当然,可以在后机溶剂〔如甲醇、乙醇〕和水溶液中进行.
〔2〕其抗氧化活性,实际上是去除氮自由基的活性〔而不是氧自由基〕.
〔3〕配制工作液需要的时间长〔约12小时〕
〔4〕ABTS+与〔NH4〕2ABTS、K2S2O8共存于溶液中,无法单独别离.所以,会导致无法预期的干扰.
去除反响速度较慢,约2小时完成.不过,如果出现这种情况,可以适当加热〔如37C、
50C〕,或延长反响时间.
所需仪器
可见分光光度计〔常量,检测?
B勺3mL〕酶标仪〔微量,检测液约200.〕
可见分光光度计〔常量,检测液约3mL〕
酶标仪〔微量,检测液约200口〕
可见分光光度计〔常量,检测液约3mL〕
酶标仪〔微量,检测液约200妙〕
【实验讲解】
1.DPPH?
自由基去除实验[1]
1.1DPPH测试液的配置
取DPPH固体1mg溶于24mL95乙醇〔或无水乙醇、甲醇〕中,超声5min,充分振摇,务使上下各局部均匀.最好避光保存,5小时内用完.取
1mL上述步骤配置好的DPPH溶液,加0.5mL95乙醇〔或无水乙醇、甲醇〕稀释后,使其吸光度为0.6-1.0之间.假设吸光度过大,那么继续加溶剂；假设吸
光度过小,那么补加DPPH固体或者原始溶液.
1.2样品液的配置
样品用适宜的溶剂溶解,为便于计算,可配成1mg/mL浓度.溶剂根据样品的极性进行选择,首选甲醇、95乙醇或无水乙醇〔尽量与DPPH溶液所
用溶剂相同〕,如不溶可用DMSOo
1.3预试
取DPPH溶液1.0mL,加0.5mL相应有机溶剂后,往其中加少量样品液.加样时,先少后多渐加,边加边混合,并观察溶液的褪色情况,当溶液颜
色根本褪去时,记下样品的加样量.如果反响缓慢可在37c烘箱中放置半个小时.
此加样量即为样品的最大用量,在此最大用量的根底上,往前设置5个用量,使之成等差数列.
【如】在预试过程中,发现加样到500时,DPPH溶液颜色根本褪去,那么500pL为该样品液的最大用量.那么对于该样品而言,其用量梯度宜设为100200妙300妙400妙500M
A0值：
取DPPH溶液1.0mL到比色皿中,加对应有机溶剂0.5mL,稀释混合,测A值,此A值为A0〔A.须在0.8-1.0之间〕.
A值：
取〔500-x〕科L有机溶剂到比色皿中,加样品液x科L〔x是根据1.3预试结果确定样品液的用量〕,再加DPPH溶液1.0mL,混合使反响液总体积为1.5mL.测A值.
【如】某样品的用量梯度为100口200dl>300^L、400口500—那么加样如下：
样品液
95乙醇〔或无水乙醇〕
DPPH测试液
总体积
0L
500
1.0mL
1.5mL
100
400科L
1.0mL
1.5mL
200科L
300科L
1.0mL
1.5mL
300
200科L
1.0mL
1.5mL
400口
100
1.0mL
1.5mL
500艮L
0uL
1.0mL
1.5mL
1.4最终测量
每测一个用量需要测三个平行数据.
1.5DPPH?
去除率〔抑制率〕的计算
去除率％=—"A100
A
〔A0为不加样品时的值；A为参加样品后的值.〕
1.6
1.6.1
1.6.2
1.6.3
1.6.4
使用考前须知
以通过,
测量前,要先用空白溶剂调零.
将溶液注入比色皿后应当充分摇匀,每次使用前后要注意比色皿的清洁.如果在实验过程中出现A值大于加样品但不加DPPH的方法测得.
使颜色均匀分布.
A0的情况,那么可能是由于样品本身产生的本底吸收所致,此时,应该减去本底吸收的此时的计算公式为：
A值〔A本〕.这个A本值可
消除率%=9—巴4100
A0
1.7疑难解答
问：
DPPH实验测量抗氧化性的原理是什么
答：
DPPH法于1958年被提出,广泛用于定量测定生物试样、分类药物和食品的抗氧化水平.此法是根据
DPPH自由基有单电子,在519nm处有一强吸收,
其醇溶液呈紫色的特性.当有抗氧化剂存在时,
可用分光光度计或酶标仪进行快速的定量分析.
问：
DPPH自由基被去除的机制是什么
答：
DPPH自由基的去除过程主要涉及到氢转移〔
OH
DPPH自由基被去除,溶液颜色减淡,其褪色程度与其被去除程度〔即吸光度的改变〕成定量关系,因而
H
psra-benzoQurnone
HAT〕,简要过程如下〔以1,3,5,8-四羟基氧杂意酮为例〕,H
DPPH*DPPH-H
DPPH*OPPH-H
问：
实验中的溶剂应该怎么确定?
答：
优先选用甲醇、95乙醇或无水乙醇溶解DPPH固体和样品,假设样品难溶于水和醇,再考虑DMSO等溶剂.值得注意的是,实验中应该尽量保证样品溶
液和DPPH溶液使用相同的溶剂.另两个实验〔ABTS+?
去除和PTIO?
去除〕同理.
问：
样品的浓度一定要设置成1mg/mL吗
答：
不同小¥品去除DPPH自由基的活性可能相差很大,为了保证结果的准确,应该尽量使样品的五个浓度点对DPPH?
去除率均匀分布在0-100%之间,因此
1mg/mL只是一个大概数值,实验中要根据预试结果进行调整.由于1mg/mL这个数字方便稀释和计算,因此在这里统一写作1mg/mL.另两个实验〔ABTS+?
去除和PTIO?
去除〕同理.
问：
测量完成后怎么计算IC50?
答：
IC50值是指去除50%的自由基,所需要的样品的最终浓度.有两种计算方法.
第一,以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标,去除率为纵坐标,然后计算线性回归方程.将去除率50%代入方程中求得对应的横坐标值即为IC50值,注意
最终结果将三次或三次以上的平行试验取平均值.第二,通过浓度曲线的图直接读出.在50%处画一横线,此横线与曲线的模拟线的交点的对应的横坐
标,即IC50.
另两个实验〔ABTS+?
去除和PTIO?
去除〕同理.
问：
为什么要用Trolox作为阳性对照
答：
维生素E〔生育酚〕是常见的抗氧化剂.不过,维生素E难溶于水,而且易变质.为此,化学家将其结构进行修饰,即得Trolox〔化学名称：
6-羟基
-2,5,7,8-四甲基色烷-2-竣酸〕.Trolox不仅溶于水,而且易溶于有机溶剂,所以,广泛地用作抗氧化剂的阳性对照物.亦称水溶性维生素E.为了方便对
比评价所测物质的抗氧化水平,通常采用Trolox作为DPPH自由基去除实验的阳性对照品.另两个实验〔ABTS+?
去除和PTIO?
去除〕同理.
问：
为什么会出现去除率为负值的情况
答：
样品的活性太弱,所以,参加的样品的量较多；如果这个样本身在519nm处有吸收的话,就会产生一个可观的A值,导致A>Ao,去除率为负.
问：
DPPH?
去除率会大于100%吗
答：
不可能.
1.8实例
茶黄素去除DPPH?
自由基数据：
样品浓度：
0.1mg/ml反响液总体积：
1.5mL
体积/uL
最终浓度Ug/mL
A0平均值
A值
去除率
1
2
3
1
2
3
Mean
SD
20
1.333
0.806
0.612
0.619
0.632
24.069
23.201
21.588
22.953
1.028
40
2.667
0.806
0.490
0.486
0.486
39.206
39.702
39.702
39.537
0.234
60
4.000
0.806
0.372
0.363
0.366
53.846
54.963
54.591
54.467
0.464
80
5.333
0.806
0.290
0.299
0.302
64.020
62.903
62.531
63.151
0.633
100
6.667
0.806
0.250
0.239
0.249
68.983
70.347
69.107
69.479
0.616
IC50〔科g/mL〕
3.998
3.975
4.056
4.010
0.034
量效曲线图〔MicrocalOrigin绘制〕:
%率除清目PD
2.ABTS•+自由基去除实验[2]
2.1溶液配制
2.1.1ABTS二俊盐储藏液〔7.4mmol/L〕:
取ABTS二镂盐3mg,加蒸储水0.735mL.〔MW=548.7〕
2.1.2过二硫酸钾〔K2s2.8〕储藏液〔2.6mmol/L〕:
取K2s2O81mg,加蒸储水1.43mL.〔MW=270.32〕
2.1.3取0.2mLABTS二钱盐储藏液和0.2mLK2S2O8储藏液混合,黑暗环境下室温放置12小时,用pH7.4磷酸盐缓冲液将混合液稀释10-20倍直至吸
光度为0.70±0.02此溶?
^即为ABTST自由基工作液.〔注：
也可以用95乙醇或无水乙醇,但必须是原装分析纯试剂,回收或重蒸者均不可用.〕
2.2样品液的配置样品用适宜的溶剂溶解,为便于计算,可配成1mg/mL浓度.溶剂根据样品的极性进行选择,首选95乙醇或无水乙醇,如不溶可用DMSO.
2.3预试取ABTS?
+自由基工作液0.8mL,往其中加少量样品液,加样时,先少后多渐加,边加边混合,并观察溶液的褪色情况,当溶液颜色根本褪去时,
记下样品的加样量.如果反响缓慢,可在37c烘箱中放置半个小时.此加样量即为样品的最大用量,在此最大用量的根底上,往前设置5个用量,使之成
等差数列.
【如】在预试过程中,发现加样到100科对,ABTS?
+自由基工作液颜色根本褪去,那么100科的该样品液的最大用量.那么对于该样品而言,其用量梯度宜
设为20pk40dh60db80db100^Lo
A0值：
取ABTS?
+自由基工作液800科参加到比色皿中,力口95乙醇〔或无水乙醇〕200妙,稀释混合,测A值,此A值为A0〔A0宜在0.70±0.02.
A值：
取〔200-x〕lL951醇〔或无水乙醇〕参加到96孔板中,加样品液x^L〔x是根据2.3预试结果确定样品液的用量〕,再加ABTS?
自由基溶液800
混合使反响液总体积为1mL,测A值.
【如】某样品的用量梯度为20db44dL60db80db100那么加样如下：
样品液95乙醇〔或无水乙醇〕ABTS?
+自由基溶液总体积
0
[1L
200
[1L
800
[1L
1000
[1L
20
[1L
180
[1L
800
[1L
1000
[1L
40
[1L
160
[1L
800
[1L
1000
[1L
60
[1L
140
[1L
800
[1L
1000
[1L
80
[1L
120
[1L
800
[1L
1000
[1L
100
flL
100
flL
800
flL
1000
flL
2.4最终测量
参照2.3节,每个浓度平行测三次.
2.5ABTS?
+去除率〔抑制率〕的计算
去除率％二至二100
Ao
〔A0为不加样品时的值；A为参加样品后的值.〕
2.6疑难解答
问：
ABTS?
+去除实验测量抗氧化性的原理是什么
答：
ABTS二钱盐,中文名：
2,2-联氮-二〔3-乙基-苯并曝陛-6-磺酸〕二钱盐,它与过二硫酸钾〔K2s2O4〕反响,可以生成绿色的ABTS?
+自由基.该自由基在734nm有最大吸收,所以,通过检测734nm的吸光度,可以测定其浓度.一个物质参加到ABTS?
+自由基工作液后,如果734nm的吸光度降低,那么说明该物质具
有自由基去除活性,属于抗氧化剂.该法称为ABTS自由基去除法,可以用评价植物〔或中草药抽提物〕、纯化合物的抗氧化水平.
问：
ABTS?
+自由基被去除的机制是什么
答：
由于ABTS?
+自由基是一种带正电荷的自由基,因此它可以从抗氧化剂分子中获得一个电子形成稳定的中性分子,故ABTS?
+自由基被去除主要涉及到
电子转移〔ET〕机制.
问：
ABTS?
+自由基工作液如何配制
答：
需要用ABTS二钱盐与过二硫酸钾反响12小时才能配制.
2.7实例
仙鹤草酚B去除ABTS?
+自由基数据：
仙鹤单酚B0.5mg/mL
加样量〔〕D
最终浓度〔gg/mL〕
吸光度A
去除
率％
平均去除
率％
SD
0.0
0.0000
0.546
0.4255
0.0000
0.46
0.548
0.0608
0.551
-0.4863
0.5
0.2500
0.465
15.1976
14.0426
1.10
0.477
13.0091
0.472
13.9210
1.0
0.5000
0.42
23.4043
24.9240
1.65
0.402
26.6869
0.413
24.6809
1.5
0.7500
0.239
56.4134
58.9058
2.18
0.22
59.8784
0.217
60.4255
量效曲线图:
2.0
1.0000
0.169
69.1793
67.7204
2.37
0.17
68.9970
0.192
64.9848
2.5
1.2500
0.103
81.2158
80.1216
0.95
0.112
79.5745
0.112
79.5745
—■一仙鹤草酚B
3.PTIO?
自由基去除实验［3］
3.1PTIO?
测试液的配置
3.1.1取PTIO固体3mg溶于20mL蒸储水中,超声5min,充分振摇,务使上下各局部均匀,得“PTIOB式液〔PTIOM.W.233.3〕
3.1.2用空白溶剂调零后,取800dL“PTO夜〞和200科缓冲液或甲醇〔与PTIO溶液中的溶剂保持一致〕于比色皿中,在557nm处测A值,即得Ao值.
Ao在0.2-0.6之间.
3.2样品液的配置
样品用缓冲液或甲醇、乙醇溶解,配成1mg/ml浓度的溶液,可适当超声使之完全溶解.如果溶解性差,浓度小于1mg/ml也可以.
3.3预试
3.3.1取“PTIO试液〞800小往其中加少量样品液,加样时,先少后多渐加,边加边混合,并观察溶液的褪色情况,不能立即褪色时那么37c水浴2小时
后再观察,当溶液颜色根本褪去时,记下样品的加样量.
3.3.2此加样量即为样品的最大用量,在此最大用量的根底上,往前设置5个用量,使之成等差数列.〔如,在预试过程中,发现加样到200科时,PTIO
溶液颜色根本褪去,那么200科的该样品液的最大用量.那么对于该样品而言,其用量梯度宜设为0dL40dh80dh120科卜160db200.
3.4A
用移液枪取“PTIOB式液〞800加I入到比色皿中,加样品液x^L〔x是根据3.3预试结果确定样品液的用量〕,再加〔200-x〕科L甲醇混合,37c水浴
〔或烘箱〕30分钟或更久后,测A557nm值.
［如］某样品的用量梯度为0dL侧出的A即A0值卜405、［80120160科、［200%L其加样表如下:
1
PTIO
0L
2000
800科L
1000
4011L
160妙
8001iL
10001iL
80妙
120妙
800口
1000
120
80妙
800科L
1000
160
40妙
800科L
1000
200口L
0/d,L
800口L
1000nL
3.5最终测量
参考3.4的操作,每测一个用量需要测3个平行数据.
3.6PTIO?
去除率〔抑制率〕的计算
AoA
100
去除率%
A0
〔A0为不加样品时的值；A为参加样品后的值〕.
3.7疑难解答
问：
PTIO?
W除实验测量抗氧化性的原理是什么
答：
PTIO溶解后为紫色溶液,当有抗氧化剂去除PTIO时,溶液的颜色会减淡,通过测量吸光度的改变可以测量物质的抗氧化性.
问：
PTIO被去除的机制是什么
答：
PTIO自由基能够在不同pH的水缓冲溶液中稳定存在,当溶液pHV5.0时,PTIO?
青除主要涉及到电子转移〔ET〕,当调节pH值〔如pH=5.0,6.0,
7.4）时,其去除水平也随之改变,说明与pH值有关,也就是说与氢离子〔质子〕浓度有关,据此,可证实其涉及PT机制.
问：
PTIO为什么比DPPH自由基难去除
o
10
%
ewopopawnevacs?
.n^TP
O
6
O
4
O
2
O
8
wopopgneVacs?
.nrTP
oB.o
O
6
O
4
O
2
O
8
O10
Concentration/（g/mL）
Trolox去除PTIO?
自由基的浓度曲线图:
Thevalueisexpressedasmean
Concentration/（
（A）pH4.5,（B）7.4.
士SD（n=3）.
\1^
mL
答：
由于PTIO?
比DPPH?
自由基稳定.所以,一般需要2小时才可以去除,当然,活性好的样品,很快也可以发生去除反响,并褪色.为了较好的实验效果,可以考虑加热或延长反响时间.
参考文献
[1]Li,X.,ComparativeStudyof1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl
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