DPPH和ABTSPTIO自由基清除试验操作图解李熙灿XicanLi.docx

1、DPPH和ABTSPTIO自由基清除试验操作图解李熙灿XicanLiDPPH?和ABTS+?自由基去除实验含 PTIO?自由基去除实验：详细说明与疑难解答李熙灿广州中医药大学中药学院,2021.7以下内容系来源于实验经验及三个参考文献1 Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl- hydrazyl Radical DPPH? Scavenging Capacity of theAntioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2021. 3,13081-13086.2 Li, X.; Ouy

2、ang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3 -Dimerization Enha/8ces the AntioxidantCapacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2021, Molecules. 24, 2039.3 Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxide PTIO? Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J.

3、 Agric. Food Chem., 2021. 65 ,6288-6297【概述】DPPH?、ABTS+?、PTIO?自由基三者,都是常用的自由基.概述如下表:DPPH?自由基ABTS+?自由基PTIO?自由基结构式Q 02KNN-d -NO20 O2Ng /.Q .* 卡简单表达式DPPHABTS - +PTIO -分子式与分子量Ci8H12N5O6; M.W. 394.3Ci8H24N6O6S; M.W. 548.68C13H17N2O2; M.W. 233.3带电情况中性自由基阳离子自由基中性自由基种类氮自由基成单电子在N原子上氮自由基成单电子在N原子上氧自由基成单电子在 O原子上外

4、观紫黑色粉末没有名O勺ABTS +紫褐色粉末溶解性与溶液颜色溶于有机溶剂如甲醇、乙醇 溶液呈紫色,浓度越高,颜色越深溶于后机溶剂如甲醇、乙醇、水以及水性的缓冲液溶液呈墨绿色,浓度越高,颜色越深溶于水以及水性的缓冲液溶液呈蓝紫色,浓度越高,颜色越深CAS号1898-66-4无18390-00-6工作液配制方法将已购的DPPH自由基粉末,溶解即得 其工作液将已贝的 ABTS二钱盐NH 42ABTS与过 一硫酸钾K 2s2O8黑暗中反响12小时后, 再稀释得其工作液.将已购的PTIO自由基粉末,溶解即得其工作 液工作液紫外光谱与 最大吸收度光吸3.02.50.5 -0.0 HI-|-|_I_|_I|

5、-R-|_I_|_I 200300400500600700800900波长/nm557nm检测波长检测原理用途400O 60I0080200(0.07mM (NH 4)2ABTS+0.03mM K 2s2O8)400600波长/nm(50 g/mL)800519 nm当A519 nm值减少,说明DPPH 被去除.其去除机制主要是氢转移 HAT(hydrogen atom transfer)主要用于测试一个纯的化合物或者提取 物,是否具有抗氧化活性或者活性的强 弱.734nm当A734nm值减少,说明ABTS +被去除.其 去除机制主要是电子转移ET (electrontransfer) 主要用

6、于测试一个纯的化合物或者提取 物,是否具有抗氧化活性或者活性的强弱.557nm (水溶液)当A557减少,说明ABTS +被去除.其清 除机制 主要是电子移 ET (electrontransfer)加质子转移 PT (proton transfer)主要用于测试一个纯的化合物或者提取物,是否具有抗氧化活性或者活性的强弱.通过调节缓冲液的 pH值,可以检测其抗氧化机制.优势去除速度较快,约 30分钟(室温下).去除速度较快,约 6分钟(室温下)(1)水溶性好,与生物相关性强；(2)是氧自由基,能更好地表往ROS去除水平；(3)抗氧化机制明确：pH值小于5.0时,为 电子转移ET机制.当调节pH

7、值(如pH=5.0 , 6.0, 7.4)时,其去除水平也随之改变,说明 与pH值有关,也就是说与氢离子(质子)浓度有美,据此,可证实其涉及 PT机制.局限性1只能在后机溶剂如甲醇、乙醇 中进行,不能在水溶液中进行；也不能 在缓冲液中进行.2其抗氧化活性,实际上是去除氮自 由基的活性而不是氧自由基.3虽然DPPH的去除主要是 HAT抽 制,但是在不同溶剂中,其抗氧化机制 是不同的,还可能有 ET等.1不能在缓冲液中进行.当然,可以 在后机溶剂如甲醇、乙醇和水溶液中 进行.2其抗氧化活性,实际上是去除氮自 由基的活性而不是氧自由基.3配制工作液需要的时间长约 12小 时4 ABTS +与NH42

8、ABTS、K2S2O8 共存 于溶液中,无法单独别离.所以,会导致 无法预期的干扰.去除反响速度较慢,约 2小时完成.不过,如 果出现这种情况,可以适当加热如37 C、50C,或延长反响时间.所需仪器可见分光光度计 常量,检测?B勺3mL 酶标仪微量,检测液约 200.可见分光光度计常量,检测液约 3mL酶标仪微量,检测液约 200 口可见分光光度计常量,检测液约 3mL酶标仪微量,检测液约 200妙【实验讲解】1.DPPH?自由基去除实验11.1DPPH测试液的配置取DPPH固体1mg溶于24mL 95乙醇或无水乙醇、甲醇中,超声 5min ,充分振摇,务使上下各局部均匀.最好避光保存,5小

9、时内用完.取1mL上述步骤配置好的 DPPH溶液,加0.5mL 95乙醇或无水乙醇、甲醇稀释后,使其吸光度为0.6-1.0之间.假设吸光度过大,那么继续加溶剂；假设吸光度过小,那么补加 DPPH固体或者原始溶液.1.2样品液的配置样品用适宜的溶剂溶解,为便于计算,可配成 1mg/mL浓度.溶剂根据样品的极性进行选择,首选甲醇、 95乙醇或无水乙醇尽量与DPPH溶液所用溶剂相同,如不溶可用DMSOo1.3预试取DPPH溶液1.0 mL,加0.5mL相应有机溶剂后,往其中加少量样品液.加样时,先少后多渐加,边加边混合,并观察溶液的褪色情况,当溶液颜色根本褪去时,记下样品的加样量.如果反响缓慢可在3

10、7c烘箱中放置半个小时.此加样量即为样品的最大用量,在此最大用量的根底上,往前设置 5个用量,使之成等差数列.【如】在预试过程中,发现加样到 500时,DPPH溶液颜色根本褪去,那么 500 pL为该样品液的最大用量.那么对于该样品而言,其用量梯度宜设为 100200 妙 300 妙 400 妙 500 MA0值：取DPPH溶液1.0 mL到比色皿中,加对应有机溶剂0.5 mL ,稀释混合,测 A值,此A值为A0 A.须在0.8-1.0之间.A值：取500-x科L有机溶剂到比色皿中,加样品液 x科L x是根据1.3预试结果确定样品液的用量,再加 DPPH溶液1.0 mL ,混合使反响液 总体积

11、为1.5 mL.测A值.【如】某样品的用量梯度为 100 口 200 dl 300 L、400口500 那么加样如下：样品液95乙醇或无水乙醇DPPH测试液总体积0L5001.0 mL1.5 mL100400 科 L1.0 mL1.5 mL200 科 L300 科 L1.0 mL1.5 mL300200 科 L1.0 mL1.5 mL400 口1001.0 mL1.5 mL500 艮 L0 u L1.0 mL1.5 mL1.4最终测量每测一个用量需要测三个平行数据.1.5DPPH?去除率抑制率的计算去除率=A 100AA0为不加样品时的值；A为参加样品后的值.1.61.6.11.6.21.6.

12、31.6.4使用考前须知以通过,测量前,要先用空白溶剂调零.将溶液注入比色皿后应当充分摇匀, 每次使用前后要注意比色皿的清洁. 如果在实验过程中出现 A值大于 加样品但不加 DPPH的方法测得.使颜色均匀分布.A0的情况,那么可能是由于样品本身产生的本底吸收所致,此时,应该减去本底吸收的 此时的计算公式为：A值A本.这个A本值可消除率% =9巴4 100A01.7疑难解答问：DPPH实验测量抗氧化性的原理是什么答：DPPH法于1958年被提出,广泛用于定量测定生物试样、分类药物和食品的抗氧化水平.此法是根据DPPH自由基有单电子,在 519nm处有一强吸收,其醇溶液呈紫色的特性.当有抗氧化剂存

13、在时,可用分光光度计或酶标仪进行快速的定量分析.问：DPPH自由基被去除的机制是什么答：DPPH自由基的去除过程主要涉及到氢转移OHDPPH自由基被去除,溶液颜色减淡,其褪色程度与其被去除程度即吸光度的改变成定量关系,因而Hpsra-benzoQurnoneHAT,简要过程如下以1,3,5,8-四羟基氧杂意酮为例 ,HDPPH * DPPH-HDPPH * OPPH-H问：实验中的溶剂应该怎么确定?答：优先选用甲醇、95乙醇或无水乙醇溶解 DPPH固体和样品,假设样品难溶于水和醇,再考虑DMSO等溶剂.值得注意的是,实验中应该尽量保证样品溶液和DPPH溶液使用相同的溶剂.另两个实验ABTS+?

14、去除和PTIO?去除同理.问：样品的浓度一定要设置成 1mg/mL吗答：不同小品去除DPPH自由基的活性可能相差很大,为了保证结果的准确,应该尽量使样品的五个浓度点对DPPH?去除率均匀分布在0-100%之间,因此1mg/mL只是一个大概数值,实验中要根据预试结果进行调整.由于1 mg/mL这个数字方便稀释和计算, 因此在这里统一写作1mg/mL.另两个实验ABTS+?去除和PTIO?去除同理.问：测量完成后怎么计算IC50?答：IC50值是指去除50%的自由基,所需要的样品的最终浓度.有两种计算方法.第一,以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标,去除率为纵坐标,然后计算线性回归方程.将去除率50%

15、代入方程中求得对应的横坐标值即为IC50值,注意最终结果将三次或三次以上的平行试验取平均值.第二,通过浓度曲线的图直接读出.在50%处画一横线,此横线与曲线的模拟线的交点的对应的横坐标,即IC50.另两个实验ABTS+?去除和PTIO?去除同理.问：为什么要用Trolox作为阳性对照答：维生素E 生育酚是常见的抗氧化剂.不过,维生素E难溶于水,而且易变质.为此,化学家将其结构进行修饰,即得 Trolox 化学名称：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-竣酸.Trolox不仅溶于水,而且易溶于有机溶剂,所以,广泛地用作抗氧化剂的阳性对照物.亦称水溶性维生素E.为了方便对比评价所测物质的抗氧化

16、水平,通常采用Trolox作为DPPH自由基去除实验的阳性对照品.另两个实验 ABTS+?去除和PTIO?去除同理.问：为什么会出现去除率为负值的情况答：样品的活性太弱,所以,参加的样品的量较多；如果这个样本身在519nm处有吸收的话,就会产生一个可观的A值,导致AAo,去除率为负.问：DPPH?去除率会大于100%吗答：不可能.1.8实例茶黄素去除DPPH?自由基数据：样品浓度：0.1mg/ml反响液总体积：1.5mL体 积 /uL最终 浓度 U g/mLA0平 均值A值去除率123123MeanSD201.3330.8060.6120.6190.63224.06923.20121.5882

17、2.9531.028402.6670.8060.4900.4860.48639.20639.70239.70239.5370.234604.0000.8060.3720.3630.36653.84654.96354.59154.4670.464805.3330.8060.2900.2990.30264.02062.90362.53163.1510.6331006.6670.8060.2500.2390.24968.98370.34769.10769.4790.616IC50 科 g/mL3.9983.9754.0564.0100.034量效曲线图Microcal Origin 绘制:% 率除清

18、目PD2.ABTS +自由基去除实验22.1溶液配制2.1.1ABTS 二俊盐储藏液7.4 mmol/L:取 ABTS 二镂盐 3 mg,加蒸储水 0.735mL.MW =548.72.1.2过二硫酸钾K2s2.8储藏液2.6 mmol/L:取 K2s2O8 1mg ,加蒸储水 1.43 mL.MW= 270.322.1.3取0.2mL ABTS二钱盐储藏液和 0.2mL K2S2O8储藏液混合,黑暗环境下室温放置12小时,用pH7.4磷酸盐缓冲液将混合液稀释10-20倍直至吸光度为0.70 0.02此溶?即为 ABTST自由基工作液.注：也可以用95乙醇或无水乙醇,但必须是原装分析纯试剂,回

19、收或重蒸者均不可用.2.2样品液的配置样品用适宜的溶剂溶解,为便于计算,可配成1 mg/mL浓度.溶剂根据样品的极性进行选择,首选95乙醇或无水乙醇,如不溶可用DMSO.2.3预试 取ABTS?+自由基工作液0.8 mL,往其中加少量样品液,加样时,先少后多渐加,边加边混合,并观察溶液的褪色情况,当溶液颜色根本褪去时,记下样品的加样量.如果反响缓慢,可在37 c烘箱中放置半个小时.此加样量即为样品的最大用量,在此最大用量的根底上,往前设置5个用量,使之成等差数列.【如】在预试过程中,发现加样到100科对,ABTS?+自由基工作液颜色根本褪去,那么 100科的该样品液的最大用量.那么对于该样品而

20、言,其用量梯度宜设为 20 pk 40 dh 60 db 80 db 100 LoA0值：取ABTS?+自由基工作液800科参加到比色皿中,力口 95乙醇或无水乙醇200妙,稀释混合,测A值,此A值为A0 A0宜在0.70 0.0 2.A值：取200-x l L 951醇或无水乙醇参加到96孔板中,加样品液x L x是根据2.3预试结果确定样品液的用量,再加ABTS?自由基溶液800混合使反响液总体积为1 mL,测A值.【如】某样品的用量梯度为 20 db 44 dL 60 db 80 db 100那么加样如下：样品液95乙醇或无水乙醇ABTS?+自由基溶液总体积01 L2001 L8001L

21、10001 L201 L1801 L8001 L10001 L401 L1601 L8001 L10001 L601 L1401 L8001 L10001 L801 L1201 L8001 L10001 L100fl L100fl L800fl L1000fl L2.4最终测量参照2.3节,每个浓度平行测三次.2.5ABTS?+去除率抑制率的计算去除率二至二100AoA0为不加样品时的值；A为参加样品后的值.2.6疑难解答问：ABTS?+去除实验测量抗氧化性的原理是什么答：ABTS二钱盐,中文名：2,2-联氮-二3-乙基-苯并曝陛-6-磺酸二钱盐,它与过二硫酸钾K2s2O4反响,可以生成绿色的

22、ABTS?+自由基.该自由基在734nm 有最大吸收,所以,通过检测 734 nm的吸光度,可以测定其浓度.一个物质参加到ABTS?+自由基工作液后,如果 734nm的吸光度降低,那么说明该物质具有自由基去除活性,属于抗氧化剂.该法称为ABTS自由基去除法,可以用评价植物或中草药抽提物、纯化合物的抗氧化水平.问：ABTS?+自由基被去除的机制是什么答：由于ABTS?+自由基是一种带正电荷的自由基,因此它可以从抗氧化剂分子中获得一个电子形成稳定的中性分子,故ABTS?+自由基被去除主要涉及到电子转移ET机制.问：ABTS?+自由基工作液如何配制答：需要用ABTS二钱盐与过二硫酸钾反响 12小时才

23、能配制.2.7实例仙鹤草酚B去除ABTS?+自由基数据：仙鹤单酚 B 0.5 mg/mL加样量D最终浓度g g/mL吸光度A去除率平均去除率SD0.00.00000.5460.42550.00000.460.5480.06080.551-0.48630.50.25000.46515.197614.04261.100.47713.00910.47213.92101.00.50000.4223.404324.92401.650.40226.68690.41324.68091.50.75000.23956.413458.90582.180.2259.87840.21760.4255量效曲线图:2.0

24、1.00000.16969.179367.72042.370.1768.99700.19264.98482.51.25000.10381.215880.12160.950.11279.57450.11279.5745一仙鹤草酚B3.PTIO ?自由基去除实验33.1PTIO?测试液的配置3.1.1取PTIO固体3 mg溶于20 mL蒸储水中,超声5min ,充分振摇,务使上下各局部均匀,得“PTIOB式液PTIO M.W. 233.3 3.1.2用空白溶剂调零后,取 800 dL “PTO夜和200科缓冲液或甲醇与PTIO溶液中的溶剂保持一致于比色皿中,在 557 nm处测A值,即得Ao值.A

25、o 在 0.2-0.6 之间.3.2样品液的配置样品用缓冲液或甲醇、乙醇溶解,配成 1 mg/ml浓度的溶液,可适当超声使之完全溶解.如果溶解性差,浓度小于1 mg/ml也可以.3.3预试3.3.1取“PTIO试液 800小往其中加少量样品液,加样时,先少后多渐加,边加边混合,并观察溶液的褪色情况,不能立即褪色时那么37c水浴2小时后再观察,当溶液颜色根本褪去时,记下样品的加样量.3.3.2此加样量即为样品的最大用量,在此最大用量的根底上,往前设置5个用量,使之成等差数列.如,在预试过程中,发现加样到 200科时,PTIO溶液颜色根本褪去,那么 200科的该样品液的最大用量.那么对于该样品而言

26、,其用量梯度宜设为0 dL 40 dh 80 dh 120科卜160 db 200.3.4A用移液枪取“PTIOB式液 800加I入到比色皿中,加样品液x L x是根据3.3预试结果确定样品液的用量,再加200-x科L甲醇混合,37 c水浴或烘箱30分钟或更久后,测 A557nm值.如某样品的用量梯度为 0dL侧出的A即A0值卜40 5、 80120160科、200 %L其加样表如下:1PTIO0 L200 0800 科 L100040 11L160 妙800 1i L1000 1i L80 妙120 妙800 口100012080 妙800 科 L100016040 妙800 科 L1000

27、200 口 L0/d, L800 口 L1000 nL3.5最终测量参考3.4的操作,每测一个用量需要测3个平行数据.3.6PTIO?去除率抑制率的计算AoA100去除率%A0A0为不加样品时的值；A为参加样品后的值.3.7疑难解答问：PTIO?W除实验测量抗氧化性的原理是什么答：PTIO溶解后为紫色溶液,当有抗氧化剂去除PTIO时,溶液的颜色会减淡,通过测量吸光度的改变可以测量物质的抗氧化性.问：PTIO被去除的机制是什么答：PTIO自由基能够在不同 pH的水缓冲溶液中稳定存在,当溶液pH V 5.0时,PTIO?青除主要涉及到电子转移ET,当调节pH值如pH=5.0 , 6.0,7.4）时

28、,其去除水平也随之改变,说明与 pH值有关,也就是说与氢离子质子浓度有关,据此,可证实其涉及 PT机制.问：PTIO为什么比DPPH自由基难去除o10%e w op opawnevacs?.nTPO6O4O2O8w op opgneVacs?.nrTPo B. oO6O4O2O8O 10Concentration/( g/mL)Trolox去除PTIO ?自由基的浓度曲线图:The value is expressed as meanConcentration/(A)pH 4.5 ,(B)7.4.士 SD (n = 3).1mL答：由于PTIO?比DPPH?自由基稳定.所以,一般需要 2小时才可以去除,当然,活性好的样品,很快也可以发生去除反响,并褪色.为了较好的实验 效果,可以考虑加热或延长反响时间.参考文献1Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl- hydrazyl