观赏植物组织培养第四章 基本操作.docx

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观赏植物组织培养第四章基本操作

第四章基本操作

第一节

•培养基的制备

任何一种培养基都是由多种化合物组成，如每次配制培养基时现配现用，影响工作效率；为减少工作量，一般常将同类药品扩大一定的倍数后，配制成浓缩液亦称母液，置冰箱中保存，可供多次使用。

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一、母液的配制

•母液的配制是把培养基中同一大类的成分按用量配制到一起，分为：

•大量元素母液

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•

•微量元素母液

•铁盐母液

•有机物类母液

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•

•也可将维生素和氨基酸类分别单独配制。

大量元素母液的配制（MS）

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微量元素母液的配制（MS）

铁盐的配制

有机化合物的配制

生长调节物的配制

•生长调节物质的每一种均要单独配制。

绝大多数生长调节物质不溶于水，须加入酒精、盐酸或碱促溶。

生长素类

•IAA、NAA溶于95％的乙醇。

•IBA溶于50％的酒精。

•2，4－D溶于1NNaOH。

•GA3溶于酒精

细胞分裂素

•KT、6－BA溶于1NHCl

•Zt溶于95％酒精

•生长调节物质的用量极微，其浓度通常以mg/mL表示。

一般配制成0.1－1.0mg/mL的溶液。

称量、溶解后定容至所需的容量，贴好标签，著名名称、浓度（mg/mL）、配制日期，存放于冰箱的冷藏室中，随用随取。

二、培养基的配制

•糖

•∣

•琼脂→混合→溶化→定容→调PH值

•∣

•药（各种母液）

•1、配制培养基时，先将已配好的各种母液从冰箱中取出，按顺序排好；准备好所需的烧杯、量筒等。

•2、根据所配制的培养基配方及体积数，称取琼脂和蔗糖，用少量的蒸馏水溶化。

•3、计算所需各种药品母液的用量，按大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节

•物质母液的顺序依次吸取，混合在一起。

4、将混合到一起的各种母液倒入已溶化的琼脂、糖溶液中，定容至所需的体积5、测定PH值，按培养的植物材料对PH值的要求，用1NHCl或　　1NNaOH调节所需的PH值，在培养基凝固前，分装到培养瓶中并封口。

6、置高压灭菌锅中进行高压灭菌。

三、培养基配方的表达

•MS+6-BA1.0+IBA0.1+糖3.0%（PH5.8）

•含义：

1、基本培养基为MS

•2、6-BA1.0即：

每升培养基加入6-BA1.0mg

•3、IBA0.1即：

每升培养基加入IBA0.1mg

•4、每升培养基加糖30g

第二节

无菌培养体系的建立一、外植体的种类及选择

•：

（一）外植体的种类

•1、带芽的外植体

•2、分化的器官和组织

•3、胚

•4、花粉和花药

•5、球茎、鳞茎、块茎

•11/1１／1特点：

•形态已基本建成，生长速度快；

•遗传性稳定；

•适于离体快繁；

•可获得脱毒苗。

•包括茎尖的顶芽、腋芽、根茎连接处的萌蘖等是组织培养中应用最多的取材部位。

2、分化的器官和组织

•包括：

嫩茎、嫩叶、形成层、根、花瓣、花萼等二倍体组织。

这些已经分化的组织经诱导后可以过渡到脱分化的状态，形成芽体或胚状体，得到完整的植株。

花卉中用叶、花

•瓣、花萼作为外植体的情况比较多。

•特点：

易发生遗传变异，不利于保持原种性；但可以扩大材料来源，提高繁殖率。

3、胚

•指自然状态下成熟胚和未成熟胚的培养。

可以使发育不完全的幼胚继续发育成植株，克服远缘杂交不育。

•特点：

带有极幼嫩的分生组织。

4、花粉和花药

•经诱导可形成单倍体植株。

•从严格的组织培养的角度讲：

花粉为单倍体（小孢子）；花药中的药隔、药壁、花丝为二倍体（体细胞），应引起注意。

5、鳞茎、球茎、块茎

•鳞茎、球茎、块茎是球根花卉组织培养中常采用的外植体。

（二）外植体的选择

•1、母株的选择

•母株具有良好的观赏性状或特殊的基因型；最好选择在温室内栽培的母株。

2、外植体的增殖能力

•木本观赏植物取幼龄植株一、二年生的枝条优于老枝条，芽的再生能力强；幼嫩的叶片比老叶片的再生能力强。

3、外植体的大小

•培养效果是一个外植体细胞总体对各因子的反应；所以外植体的表面积、体积、细胞数目影响培养效果。

•外植体大，易成活，但易污染；外植体小，不易成活，污染率低。

4、取材的季节与时间

•休眠芽分化能力强；（1－3月份取芽），当年形成的芽生长弱，影响分化。

具体应根据培养的对象确定最佳的取材时间。

如百合鳞片外植体，春秋季取材培养易形成小鳞茎，而2－3月份或5－11月所取的外植体不易形成小鳞茎。

二、基本的灭菌方法

•组织培养为无菌操作和无菌条件下的培养，灭菌是日常工作。

•灭菌方法：

分为物理灭菌和化学灭菌。

（一）物理灭菌

•物理方法灭菌：

•利用高温、射线或滤膜过滤除菌等物理措施而实现除菌等目的。

1、高压蒸汽灭菌是将需灭菌的物品置高压灭菌锅内进行灭菌。

常用于培养基、无菌水、接种工具、容器等的灭菌。

•2、高温干热或灼烧灭菌

干热灭菌：

是利用烘箱加热到160－180℃（2－3小时）的温度杀死微生物。

–灼烧灭菌：

–是针对接种用具灭菌的。

–在接种操作前或在操作过程中，将操作工具与接种材料直接接触的部分，在酒精灯的外焰上灼烧至尖端部分烧红为止，可有效杀灭微生物。

是目前接种操作普遍采用的灭菌方法。

•接种器械消毒器采用电加热灭菌，没有明火、安全、灭菌效果很好。

•3、过滤灭菌

–包括空气过滤灭菌和液体过滤灭菌。

–空气或液体通过过滤膜后，杂菌的细胞和孢子的直径大于滤膜孔径而被阻。

液体过滤灭菌主要用于对高温、高压不稳定的物质的灭菌。

•4、射线灭菌

–紫外线照射灭菌。

常用于接种室空气的杀菌。

–射线灭菌直接、操作简便，但对人的眼睛和皮肤有伤害。

•

（二）、化学灭菌

–利用具有杀菌作用的化学药剂配制成一定的浓度，对空气、物体表面、外植体材料、各种用具等进行灭菌处理。

是目前组织培养外植体材料消毒的主要灭菌方法。

如，新洁尔灭、70％酒精等。

（三）具体灭菌技术

•1、接种室、培养室的灭菌：

•接种室灭菌：

采用紫外灯照射、化学药剂熏蒸；

培养室灭菌：

化学药剂熏蒸、新洁尔灭擦洗、75％酒精喷雾。

2、培养基的灭菌

•多采用高温高压灭菌。

高压灭菌锅经加热，内锅压力达0.5kg/cm2时，放出冷空气，关闭气阀，压力继续升至1.1kg/cm2（120℃），保持20分钟，可达到灭菌的目的。

3、器皿及接种工具灭菌

•高压灭菌：

清洗干净的器皿或接种用具用纸包好、包严，放入高压灭菌锅中进行灭菌。

•干热灭菌：

将包好的器皿或接种工具置电热箱中，温度升至100℃时，，启动箱内鼓风机，使温度均匀。

当温度升至160℃时，定时控制1小时，达到灭菌目的。

4、特殊药品的灭菌

•IAA、赤霉素、维生素类等遇热易分解的化学药品需用过滤和抽滤灭菌。

•过滤除菌是使溶液通过孔径为0·2－0·45的过滤网，而菌类的细胞和孢子不能通过，而达到除菌的作用。

抽滤除菌须有抽滤除菌装置。

三、无菌材料的建立

•

（一）外植体的污染途径

•

（二）外植体的消毒

（一）外植体污染的途径

•1、污染原因

•2、造成污染的菌类

•3、减少外植体带菌的措施

1、引起污染的原因

•a、外植体带菌

•b、培养基及器皿灭菌不彻底c、接种工具灭菌不彻底d、超净工作台风力不够真菌污染的原因

•试材本身带有真菌；培养基灭菌不彻底；

•周围环境不清洁和空气污染造成；如接种室的空气不洁净、操净工作台过滤装置失效或操作时不慎使真菌孢子落入瓶内。

细菌污染的原因外植体灭菌或培养基灭菌不彻底；接种工具消毒不彻底；操作人员的呼吸；操作人员的手触及培养器皿、接种工具.

3、减少外植体带菌的措施

•温室生长的植株少于田间；

•当年形成的外植体少于经休眠的外植体；避免雨天从田间取材；晴天取材下午少于早晨；冬季少于夏季。

（二）外植体的灭菌

•组织培养所用的外植体多数取自于自然环境，因而带有大量的微生物，这是组织培养无菌要求的一大障碍。

也是组织培养成功必须逾越的第一关。

因此，取回的外植体必须首先进行消毒。

1、常用的消毒剂

•药品名称（消毒剂）使用浓度（％）消毒时间

•

•酒精70－7515－30秒

•氯化汞0.1－0.23－10分钟

•次氯酸钠2－1015－30分钟

•次氯酸钙10－155－30分钟

（漂白粉）

•过氧化氢6－126－12分钟

（H2O2）

•吐温（80）0.1（杀菌兼湿润）

2、外植体的灭菌方法

•外植体→去除无用组织→洗涤剂清洗或浸泡→自来水冲洗0.5～1小时→药剂消毒→无菌水冲洗5遍→接入培养基。

3、材料的接种

•

（1）、无菌操作要求

•a、接种室用紫外灯杀菌30分钟，紫外灯关闭后，工作人员方可进入；

•b、接通超净工作台电源，开启台内的紫外灯或风机，15分钟后可关闭紫外灯进行操作；

•c、操作人员用肥皂洗手，坐在操作台前用70％酒精棉擦拭双手和工作台面；

•d、对接种用具进行消毒灭菌。

•

（2）材料的分离、切取和接种

•一般接种较大的外植体直接在肉眼下用解剖刀或接种针进行分离或切割；切割下来的外植体接种到培养基中，并及时盖好瓶盖。

注明接种日期、材料名称或代号，接种完毕置培养室中进行培养。

•4、初代培养

•将从植物体分割下来的外植体进行的第一次培养，称为初代培养。

是培养成功与否的第一环节。

•影响初代培养成功的因素：

•1、培养材料的基因型；

•2、培养材料的年龄和生理状态；

•3、取材时间；

•4、外植体部位及大小；

•5、外植体组织的受害程度；

•6、培养条件（温度、光照、培养基成分）

•7、是否被污染

•

•第三节

•外植体的生长与分化（继代培养）

•

•获得了无菌的材料，初代培养成功后，还需要诱导外植体生长与分化，以便能增殖并继代繁殖下去。

•一、外植体发生的途径

•离体培养的器官和组织，最终是要植株再生，形成一棵完整的植株，其形成的途径必是下列途径之一。

•植株再生：

•通过组织培养技术将植物的细胞、组织、器官培养成完整植株的过程。

•1、器官型

•原来是什么器官，培养出来的还是什么器官；新的器官是原来器官的连续，其中最常见的就是芽生芽，即不定芽或丛生芽。

是观赏植物快速繁殖的最佳途径。

繁殖系数适中，变异性小。

•2、器官发生型

•新的器官不是原有器官的连续，而是重新产生的。

该途径易产生变异。

•脱分化：

指在母体中原已分化并具有一定功能的植物细胞，脱离母体后，在人工培养条件下由成熟状态回复到无结构的分生状态。

•愈伤组织是典型的脱分化组织。

•愈伤组织：

又叫愈合组织。

它是植物体受伤后在本身内源激素及培养基中外源激素的

•共同作用下，细胞反复分裂形成的。

•3、原球茎型

•原球茎是一种类胚组织。

是兰花组织培养过程中特有的一种繁殖体。

•以兰花的茎尖和腋芽为外植体经培养可直接产生原球茎。

•4、胚状体途径

•胚状体：

•又称体细胞胚，是愈伤组织再分化过程中类似于种胚的、具有极性的体细胞胚，也可由器官直接产生。

•胚状体具有数量多，结构完整，易成苗和繁殖速度快等特点。

是植物离体无性繁殖最快的方法，也是人工种子和细胞工程的常用的发生途径。

•目前的研究只有100多种植物能够产生胚状体。

•二、试管苗的增殖与继代培养

•继代培养：

是指将初代培养成功后的培养体（芽、苗、原球茎）转接到增殖培养基中，进行进一步的增殖培养，使之数量扩大，每转接一次为一代，可细分为第一代，第二代，第三代…等。

•继代培养阶段具有以下特点：

•A、是数量扩大的阶段，多数花卉是以几何级数增长；

•B、细胞分裂素起主要作用；

•D、增殖率和增殖速度影响生产成本。

•

（一）影响试管苗继代培养的主要因素

•1、培养基及培养条件的影响

•培养材料的基因型

•培养基成分

•添加物的影响

•PH值的影响

•培养条件的影响主要表现为温度、光照的影响。

•不同的植物种类，同一植物的不同品种及同一植物不同器官、不同部位，继代增殖能力不同，一般为：

草本〉木本；被子植物〉裸子植物；年幼外植体〉年老外植体。

•

•2、继代培养时间

•继代培养的代数对增殖率有影响，有些花卉种类经多次继代培养仍可保持原有的再生能力，如，月季、火鹤等。

•有些继代次数的增加，分化增殖能力减弱，如，杜鹃等。

•3、培养季节的影响

•有些花卉继代培养与季节有关，如，水仙6－7月份的鳞茎由于夏季休眠，生长变慢，8月份以后生长、分化速度加快。

•进行球根花卉组织培养时，继代培养不增殖，多数是因进入休眠。

（二）继代培养过程中应注意的问题

•1、试管苗的褐化

•是指培养的外植体组织中的酚类物质在多酚氧化酶的作用下，氧化成褐色的醌类物质，这类物质呈棕褐色，并逐渐扩散到培养基中，抑制其他酶的活性，对培养的植物材料产生毒害作用；以致死亡。

•酚类物质在完整的组织和细胞中单独存在，当切割外植体时，切口附近的细胞受到伤害，酚类物质不稳定，在多酚氧化酶的作用下迅速分解，变为褐色的醌类物质。

•醌类物质与外植体中的蛋白质发生聚合，扰乱组织的代谢活动，使生长停滞，甚至死亡。

褐化程度与下列因素有关：

•

（1）、植物材料的基因型

•在组织培养过程中具有褐化现象的观赏植物有：

牡丹、芍药、红瑞木、紫叶黄栌、卡德兰、凤梨、郁金香、倒挂金钟、大岩桐、风玲草等。

•褐化导致了一些植物的成功培养。

•

（2）、培养材料的生理状态外植体的生理状态不同，褐变程度也有所不同，所取的外植体的母株处于童期，褐变程度轻于来自成年植株的外植体。

•多酚氧化酶活性高时，褐化严重。

•（3）、取材时期

•一般以冬春季取材褐化程度最轻，如牡丹。

•美国红栌6月份取材，成功率高。

•同一中材料褐化的季节性差异主要由于植物体内酚类含量和多酚氧化酶活性的季节性变化。

•（4）、外植体部位及大小

•取材部位及外植体大小不同，褐化程度不同，如，牡丹小芽褐化轻于大芽；

•苹果顶芽褐化轻于侧芽。

•（5）、外植体组织受伤害程度

•接种时，组织的受伤害程度直接影响褐化；伤口越大，褐化越严重。

•使用的消毒药剂种类，影响褐化的发生；鹤望兰用氯化汞消毒比使用次氯酸钙灭菌，褐变程度轻。

•（6）、光照和温度

•光照和温度均可影响酶的活性，黑暗条件下酶的活性降低，所以，适当采取暗培养，可不同程度的控制褐化。

•一般认为：

高温能促进酚类氧化，低温可以抑制酚类化合物的合成，降低多酚氧化酶

•的活性，减少酚类氧化，从而减轻褐化。

•（7）、培养基的影响

•培养基中无机盐的浓度过高，容易引起酚类物质的氧化；细胞分裂素具有刺激多酚氧化酶活性的作用。

•液体培养基有利于有毒物质的扩散。

•克服褐化的措施：

•1、选择适宜的的取材时间和取材部位；

•2、对于易褐变的培养材料，注意改善培养条件；

•3、连续转接或勤换培养基；

•4、培养基中加入抗氧化剂和吸收剂

•

•抗氧化剂包括：

•抗坏血酸（Vc）、半光氨酸

•吸收剂：

聚已烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP）

•活性碳（AC）

2、试管苗的玻璃化现象

玻璃化：

是初代培养、继代培养过程中出现的一种生理失调或生理病变。

•表现为：

叶片乃至整株苗，呈水浸状或半透明、肿胀、卷曲或皱缩、脆弱易折。

•玻璃化现象的危害：

•玻璃化苗体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素、木质素含量低。

•危害：

a、光和能力和酶活性降低；

•b、组织畸形；

•c、器官功能不全；

•d、分化能力降低；

•e、生根困难，难于移栽困难。

引起玻璃化的原因：

•一般认为：

•a、液体培养是导致玻璃化的主要原因；

•b、培养瓶的透气性差；

•c、6－BA的浓度过高易产生玻璃化苗。

•引起玻璃化的原因较复杂，目前没有明确的结论。

克服玻璃化的途径：

•a、增加培养基中琼脂的浓度；

•b、提高培养基中蔗糖含量；

•c、适当降低N和Cl元素比例，尤其降低铵态N浓度；

•d、适当降低细胞分裂素浓度；避免过高的培养温度。

•第四节试管苗生根及移栽

•一、生根培养

•经过继代培养，形成了大量的无根苗，需经过诱导生根，方可得到完整的植株移栽。

组织培养苗多采用试管内生根，是试管繁殖的第三阶段。

生根培养的同时具有壮苗作用。

•生根培养的关键环节：

•1、基本培养基

•诱导生根的基本培养基需降低无机盐浓度；一般将原培养基中的无机盐浓度减至1／2－1∕4。

•2、生长调节剂

•诱导生根阶段，生长素对生根起主要作用。

一般去掉细胞分裂素；或用量极微。

•3、糖的用量减半或减至原用量的1／3。

•4、其它附加物质

•生根培养阶段添加一些其他物质有利于生根；最常见的，在生根培养基阶段加入活性炭可促进试管苗的生根。

•5、培养条件

•光照强度和光照时间的影响较复杂，一般适当增加光照，可促进生根。

•培养温度对生根有影响，一般22－25℃有利于生根。

•不同的植物材料、不同基因型，生根的难易程度不同.如，牡丹的试管植株生根较难。

•一般木本难于草本；乔木难于灌木；

•二、试管苗的锻炼

•

（一）试管苗的特点：

•试管苗长期在弱光、恒温、高湿的特殊环境下生长、增殖，生理特性与自然界中生长的植株有所差异。

•1、根：

•无根毛或根毛较少；因此根系的吸收能力弱，难以满足小苗蒸腾作用的消耗，因此极易造成萎蔫。

•2、从愈伤组织诱导的根与植物体的输导系统不相通；

•3、叶片：

•a、叶片保护组织不发达，角质层没有或不发达，质地柔弱，叶组织间隙大，

•b、光和作用能力弱；试管苗生长在含糖的培养基中，光和气体交换受到限制。

•c、气孔开张大，不能关闭,与自然生长的植株相比结构明显不同，气孔保卫细胞较圆,因此容易失水萎蔫。

•4、组织：

•组织幼嫩，结构松散，细胞含水量高，机械组织不发达，易损伤、对病虫害敏感；极易被杂菌侵染而导致全军覆灭。

•

（二）炼苗

•试管苗是在特殊环境下的增殖与生长,从试管内移栽到试管外的过程是:

•异养→自养;

•无菌→有菌;

•相对恒温→变温

•高湿→低湿

•弱光→强光

•为了使试管苗逐渐适应移栽后的自然环境，移栽前对试管苗进行提高适应能力的锻炼。

这个过程也称之为炼苗或驯化。

•炼苗（驯化）的作用：

•1、通过增强光照强度、环境湿度的降低以及变温环境促进茎叶保护组织的形成，减少水分散失；

•2、降低气孔开张度，逐渐恢复气孔功能；

•3、促进新根发生。

•炼苗需掌握的关键点：

•1、生根状态：

•一般当试管苗根长长至0.5－1.0cm时，进行锻炼最佳；

•2、炼苗的光照强度：

•一般炼苗时不宜在全光照下，个别喜阳花卉光照强度可稍大，玉簪、月季等应在蔗阴网下炼苗。

•3、炼苗时间：

•试管内的生根苗，长长至0.5－1.0cm时，将培养容器从培养室中移至温室，约7－10天，再将瓶盖去掉，锻炼2－4天后，可进行移栽。

•三、移栽及管理

•1、移栽基质及容器：

•试管苗的移栽基质以疏松、透气、保水性能良好、杂菌少的基质为宜。

•移栽程序：

•移栽容器、基质消毒→基质装入容器→取苗→清水中涮洗→清理枯叶及较长的根→栽苗→喷雾→覆盖薄膜→定时喷雾、定时通风。

•常用的基质：

•蛭石、珍珠岩、河沙、炉灰渣、草碳、椰糠等。

•移栽前基质要采取消毒措施。

•基质的消毒：

•初次使用的蛭石、珍珠岩可直接使用，不需消毒。

•需要消毒的基质可喷洒高锰酸钾溶液，少量的基质也可采用高压灭菌。

•移栽容器：

•塑料盘、穴盘、塑料营养杯等。

•将移栽基质用清水淋透

•2、试管苗移栽

•用镊子将试管苗从培养容器轻轻夹出，在清水中将黏附在根部的培养基涮洗干净，用小剪刀剪去较长的根及死组织。

•将试管苗植入穴中，用基质将小苗根茎部穴坑埋平、轻压已植入容器中的植株要随栽随喷水，保持湿度。

•容器栽满后，在容器上方罩透明的塑料薄膜，保持小环境相对湿度在80％以上。

避免由于低湿环境造成植株失水萎蔫而死亡。

•3、移栽后的管理：

•A、每天定时雾状喷水，保持湿度；并置于蔗阴网下，温度在20－25℃为宜。

B、注意有无杂菌浸染植株，一旦发现基质或植株周围有杂菌侵染应立即清除或立即喷施杀菌剂。

C、移栽一周后，每天将覆盖的薄膜局部掀开通风1－2次；

D、移栽二周后可逐渐揭去薄膜，植株可由新根长出，三周后基本保证成活。

•E、移栽一周后，配制营养液，喷施在植株表面，以补充基质中的营养不足和自养能力弱的问题。

•移栽成活约一个月后，即可移入较大的营养杯或盆中，可用较有营养的土做为基质，无需其他消毒措施；以后可逐渐移到田间。

•第五节器官、胚胎及细胞培养

•一、器官培养

•

（一）、茎尖培养

•茎尖培养严格的讲是切取茎尖分生组织和普通茎尖，接种到人工配制的培养基上进行快速繁殖的组织培养过程，是组织培养中应用最多的一个取材部位。

•能够保持其遗传稳定性。

•茎尖培养的应用：

•1、快速繁殖的应用（器官型）

•用于具有优良观