第四章植物器官的培养.docx
《第四章植物器官的培养.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第四章植物器官的培养.docx（11页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
第四章植物器官的培养
第四章植物器官的培养
1、器官培养包括离体的根、茎、叶、花器和果实的培养。
以器官作为外植体进行离体培养。
器官培养的意义:
研究器官生长、营养代谢、生理生化、组织分化和形态建成
在生产实践上具有重要的应用价值,可在短期内提高繁殖速率,进行名贵品种的快速繁殖;利用茎尖培养可得到脱毒试管苗,解决品种的退化问题,提高产量和质量;
将植物器官作诱变处理,用器官培养可得到突变株,进行细胞突变育种等。
第一节营养器官的培养
一、茎尖的培养
茎尖培养是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分,进行无菌培养。
这是组织培养中用得最多的一个取材部位。
茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为微茎尖培养和普通茎尖培养。
微茎尖指带有1-2个叶原基的生长锥,其长度不超过0.5mm。
普通茎尖指较大的茎尖（如几mm到几十mm）、芽尖及侧芽。
普通茎尖培养
（1）取材:
挑选杂菌污染少,生长不久的茎尖。
（2）消毒接种:
将茎尖切成0.5-1.Ocm长
将茎尖置于流水冲洗2-4h
在75%的酒精中处理30s
在稀释20倍的次氯酸钠中浸5-8min
无菌水冲洗数次
接种
（3）接种:
为了减少污染,可在接种前再剥掉一些叶片,使茎尖为0.5cm左右大小。
（4）培养的方法和程序
①培养基多数茎尖培养采用MS作为基本培养基,常用的其他培养基有White,Heller.
培养基中生长素:
2,4-D,IAA,NAA,浓度一般用0.1mg/L左右,高于此浓度,往往产生畸变芽或形成愈伤组织。
茎尖在培养过程中会出现生长太慢、生长太快和生长正常等三种类型。
生长太慢:
接种后茎尖不增大,只是茎尖逐渐变绿,出现绿色小点,细胞逐渐老化而进人休眠状态,或者逐渐变褐死亡。
引起的原因:
生长素浓度太低,或是温度过低或过高;
生长太快型是接种后茎尖迅速增大,在茎尖基部产生愈伤组织,并迅速增殖,而茎尖不伸长,久之茎尖也形成愈伤组织,从而丧失发育成苗的能力。
引起的原因:
一是生长素浓度过高,引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组织的形成。
二是光照太弱或温度太高。
生长正常型是接种后茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织,茎尖颜色逐渐变绿,并逐渐伸长,叶原基发育成可见的小叶,进而形成小苗。
②培养条件:
接种到培养基上的茎尖,置于培养室中培养,每天照光16h,照度1500-30001x,温度通常在25±2℃。
③继代培养:
继代培养可用MS培养基。
④诱导生根:
诱导生根通常采用1/2MS培养基。
MS培养基的各种组成成分用量均减半的培养基。
并加入一定的生长素类调节物质,如NAA、IBA等。
（5）移栽入土在生根培养1个月左右,新梢基部生有较浓密的不定根,长度在l0-15cm左右,就可移栽人土。
二、茎尖的培养与无病毒苗的培育
热处理脱毒
1、热处理法又称温治疗法（theomtherapy）
（1）温汤浸渍处理:
适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料,在50C左右的温水中浸渍10min至数小时,方法简便易行,但易使材料受伤。
（2）热空气处理:
热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好,将生长的盆栽植株移人温热治疗室（箱）内,一般在35-40℃。
处理时间因植物而异,短则几十分钟,长可达数月。
三、茎尖培养脱毒
1、茎尖培养脱毒原理
感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀,病毒的数量随植株部位及年龄而异,越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低,生长点（约0.1-1.0mm区域）则几乎不含或含病毒很少。
这是因为生长点、分生组织细胞是活跃分裂的细胞,其区域内无维管束,病毒只能通过胞间连丝传递,赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。
在切取茎尖时越小越好,但太小则不易成活,过大又不能保证完全除去病毒。
2、培养基
以White、Morel和MS培养基作为基本培养基,尤其是提高钾盐和铵盐的含量会有利于茎尖的生长。
提高适当浓度的生长素（0.1-0.5mg/L）与细胞分裂素
在生长素中应避免使用易促进愈伤组织化的2,4-D,宜换用稳定性较好的NAA或IBA
细胞分裂素可用Kt或BA。
GA3对某些植物茎尖培养是有用的
有时茎尖培养添加活性炭
3、茎尖培养方法
接种工具:
解剖镜（8-40倍）,一套解剖刀。
剥离茎尖时,应尽快接种。
将接种好的茎尖置于22℃左右的温度下。
每天以16h,2000-3000Lx的光照条件下培养。
在低温和短日照下,茎尖有可能进入休眠;所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。
微茎尖需数月培养才能成功。
4、影响微茎尖培养的因素
1）外植体大小
在最适培养条件下,外植体的大小决定茎尖的存活率,外植体越大,产生再生植株的机会也就越大,而外植体越小脱毒效果越好。
叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力,一般认为,叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。
2）培养条件
在茎尖培养中,光下培养的效果通常比暗培养效果好
3）外植体的生理状态
茎尖最好要由活跃生长的芽上切取,培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好,一般选萌动期较好。
四、其他途径脱毒
1、愈伤组织培养脱毒
通过植物的器官和组织的培养脱分化诱导产生愈伤组织,然后从愈伤组织再分化产生芽,长成小植株,可以得到无病毒苗。
2、茎尖微体嫁接
木本植物茎尖培养难以生根成植株,将实生苗砧木在人工培养基上种植培育,再从成年无病树枝上切取0.4-1.0mm茎尖,在砧木上进行试管微体嫁接,以获得无病毒幼苗。
3、化学疗法脱毒
化学药品对离体组织和原生质体具有脱毒效果。
常用的药品有:
8-氮鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。
五、无病毒植物的利用
1、无病毒苗的保存繁殖
无病毒植株有可能很快又被重新感染。
所以一旦培育得到无病毒苗,就应很好地隔离与保存。
这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用5-10年。
无病毒苗应种植在隔虫网内,使用300目（网眼为0.4-0.5mm大小）的网纱,可以防止蚜虫的进入。
通过离体培养进行繁殖和保存。
2、无病毒苗的利用
3、无病毒苗的效果
无病毒苗可以表现出明显的优良效果,可增产20-50%。
…其它营养器官培养
（一）、离体根的培养
意义:
可进行根系生理和代谢的研究。
由根细胞可再生成植株,可证明根细胞的全能性并产生无性繁殖系。
培养方法:
（1）培养基:
多为无机离子浓度低的White培养基,其他培养基如用MS,B5等,浓度稀释到2/3或1/2。
（2）根无性繁殖系的建立:
培养条件为暗光,25-27℃。
（3）植株再生培养:
根段的离体培养也可以用来再生植株。
过程:
种子消毒--切取长0.6-1.2厘米的根尖--接种--萌发侧根--取侧根培养--离体根无性系
（二）、茎段的培养
茎段培养指不带芽和带1个以上定芽或不定芽的,包括块茎、球茎在内的幼茎切段的无菌培养。
主要目的:
是快繁,探讨茎细胞的生理特点,进行育种上的筛选突变体的过程。
茎段培养用于快速繁殖的优点在于:
培养技术简单易行,繁殖速度较快;芽生芽方式增殖的苗木质量好,且无病,性状均一;解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖问题等。
（1）材料的选择和处理:
取材时注意茎的基部比顶部切段,侧芽比顶芽的成活率低,也可利用腋芽,茎上部的腋芽培养效果较好。
（2）培养:
MS培养基,培养条件保持25℃左右。
在茎段培养中,促进腋芽增殖用6-BA是最为有效的,依次为Kt和Zt等。
生长素虽不能促进腋芽增殖,但可改善苗的生长。
GA对芽伸长有促进作用。
继代扩繁是茎段培养的主要一步。
这可由二种途径解决:
一是促进腋芽的快速生长,好处是不会产生变异能保持品种优良特性。
每年从一个芽可增殖10万株以上。
二是诱导形成大量不定芽,产生变异。
生根培养:
在生根培养中不需要加细胞分裂素。
生长素的浓度,NAA一般0.1-1.0mg/L,IBA和IAA可稍高。
MS,B5,White等培养基,都可用于诱导生根.或降低到1/2,1/3或1/4,甚至更低的水平。
生根培养时增强光照。
（三）离体叶的培养
离体叶培养包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。
它大多经脱分化形成愈伤组织,再由后者分化出茎和根。
（1）材料选择及灭菌
（2）接种把灭菌过的叶组织切成约0.5cm见方小块或薄片（如叶柄和子叶）,接种在MS或其他培养基上。
培养基中附加BA1-3mg/L,NAA0.25-lmg/L。
（3）培养叶接种后培养条件为每天10-12h光照,光强1500-30001x。
分化培养基的细胞分裂素含量为2mg/L左右,约10d左右将发育成无根苗。
若再将苗移至含NAA0.5-lmg/L的生根培养基可诱导成根,从而发育形成完整植株。
叶的培养比胚,茎尖和茎段培养难度大。
幼叶比成熟叶易培养,子叶比叶片易培养。
其次要添加适当的生长素和细胞分裂素,保证利于叶组织的脱分化和再分化。
第二节生殖器官的培养
一、花器官和种子的培养
1.花器官培养
花器官培养指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。
意义:
了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用
了解花器各部分对果实及种子发育所起作用
了解内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用
生产上可用于珍贵品种的扩大繁殖。
其培养方法如下:
（1）取材
从健壮植株上取未开放的花蕾作外植体材料,先用75%酒精浸润约30s,再用饱和漂白粉浸泡10-15rain,取出用无菌水冲洗数次。
（2）接种培养
常用的培养基有MS、B5等。
若要把花器官部分培育成小植株,要加入生长激素和细胞分裂素,诱导形成愈伤组织或胚状体,再分化培养成植株。
如菊花的花瓣接在含6-BA2mg/L、NAA0.1的MS培养基上,在26℃,15001x光照.下,每天光照10h,培养约1周,形成少量愈伤组织。
再经1个月就分化出绿色芽点,再切割转接,可形成大量无根苗,经长根成植株,用于繁殖。
2.种子培养
种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成熟种子的无菌培养。
意义:
利用种子培养可以打破种子休眠
可以作为大量生产试管苗的好材料,它具有植株分化容易,无菌操作方便等特点。
可使远缘杂交产生的杂种败育种子,正常萌发产生第二代植株。
培养技术如下:
（1）种子灭菌
种皮厚或不饱满的种子,宜用0.1%升汞消毒10-20min。
幼嫩的或发育不全的种子,宜用饱和漂白粉消毒15-30min。
若种子上有绒毛或蜡质,应先用95%酒精或吐温40处理,提高消毒效果。
对壳厚难萌发的种子,可去壳培养。
（2）培养基若以促进种子萌发为目的种子培养,培养基的成分要求较简单,可不加或少加生长激素。
种子培养的糖浓度可稍低,一般1%-3%。
（3）接种培养种子培养的接种较容易,把种子按每瓶3-5粒放人培养瓶中,均匀排列,放在20-28℃的条件下培养,1000-20001x光强,每天光照10h。
二、胚胎的培养
植物胚胎培养是胚及胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌条件下,使胚发育成幼苗的技术。
包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。
1.胚胎培养的意义
（1）克服远缘杂种的不育性在高等植物的种间和属间杂交后代胚败育,胚发育不全而不能正常萌发,因而得不到杂种种子,用胚胎培养和试管受精技术就可以解决这些问题。
（2）使胚发育不全的植物获得后代如兰花、天麻的种子成熟时,胚只有6-7个细胞,多数胚不能成活。
如在种子接近成熟时,把胚分离出来进行培养,就能生长发育成正常植物。
（3）缩短育种年限在杂交育种中,应用胚培养技术可以缩短育种周期1-2年。
2.离体胚培养
植物在受精后,受精卵形成合子,随即进行第一次分裂,进而形成分生组织和幼胚,再发育成成熟胚。
在这个过程,胚靠消耗胚乳的营养而发育,同时胚处在胚囊环境中,可吸收氨基酸、维生素等营养。
离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚,一般可分为成熟胚和幼胚培养。
（1）成熟胚培养成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。
它培养较易成功,在含有无机大量元素和糖的培养基上,就能正常生长成幼苗。
由于种子外部有较厚的种皮包裹,不易造成损伤,易于进行消毒,因此,将成熟或未成熟种子用70%酒精进行几秒钟的表面消毒,再用无菌水冲洗3-4次,然后在无菌条件下进行解剖,取出胚并接种在适当的培养基上培养。
（2）幼胚培养
幼胚是指子叶期以前的幼小胚,可使心形期胚或更早期的长度仅0.1-0.2mm的胚生长发育成植株。
由于胚越小就越难培养。
所以,尽可能采用较大的胚进行胚养。
现在幼胚培养成功的有大麦、荠莱、甘蔗、甜菜、胡萝卜等。
在未成熟胚胎的培养中,常见有三种明显不同的生长方式,
继续进行正常的胚胎发育,维持“胚性生长”;
在培养后迅速萌发成幼苗,而不继续进行胚性生长,通常称为“早熟萌发”;
胚在培养基中能发生细胞增殖形成愈伤组织,并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。
幼胚培养的关键是提供幼胚所必需的营养和环境条件。
影响条件:
（1）培养基成熟胚对培养基要求不高,而幼胚要求较高,常用的培养基有Tukey,MS,B5,Nitsch培养基,其中前者适于成熟胚培养,其他适于未成熟胚和幼胚培养。
（2）幼胚需要较高的蔗糖浓度提供较高的渗透压:
幼胚在自然条件下赖以生存的是无定形的液体胚乳,并具有较高的渗透压,所以人工培养基中要创造高渗透压的条件:
调节胚的生长,抑制胚的萌发,
避免把细胞的伸长状态转化为分裂状态。
（3）生长调节物质
不同植物的胚培养需要的生长物质不同,如IAA可明显促进向日葵胚的生长。
IAA,Kt的共同作用可促进荠菜幼胚的生长（荠菜十字花科野生蔬菜）。
一般认为IAA可使胚的长度增加,加入BA利于胚的生存。
通过渗透过程阻止细胞伸长:
在平衡的激素控制系统中,一种或几种成分的活性,依次被高浓度的蔗糖或高浓度盐所控制.
（4）天然提取物的作用:
椰乳对胚培养有一定的促进作用,如番茄胚在含有50%椰乳的培养基中可维持生长。
另外对胡萝卜、幼小子叶阶段的离体胚培养,也有促进作用。
瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力,可能是植物激素的细胞分裂物质和一些有机氮化合物作用的结果。
（5）温光条件对于大多数植物的胚来说,在25-30℃为宜,
早熟果树如桃的种胚,必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长,而马铃薯胚以20℃为好。
光照可以促进某些植物胚的转绿,利于胚芽生长,而黑暗则利于胚根生长。
因此以光暗交替培养较为有利。
（6）其他条件在胚培养中除要求有较高的蔗糖浓度、高渗透压,高浓度的氨基酸及无机盐。
三、胚珠的培养
胚珠培养是将授粉的子房在无菌的条件下解剖后,取出胚珠置于培养基培养的过程。
有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。
胚珠培养可以解决像兰科植物成熟胚较小不易培养的问题。
在未受精的胚珠培养中,可诱发大孢子发育成单倍体,用于单倍体育种。
对胚珠进行培养时,首先从花中取出子房进行表面消毒,然后在无菌的条件下进行解剖,取出胚珠,放在培养基上进行培养,基本培养基一般均用Nistch培养基,MS、N6、B5等培养基也可采用。
将胚珠培养成植株的关键是选择胚的发育时期,实验证明发育到球形胚期的胚珠较易培养成功。
带胎座甚至带部分子房的胚珠进行培养易于成功。
四、胚乳的培养
胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的3倍体组织。
由它可获得无子结实的3倍体植株,进而可将它加倍成6倍体植株。
取授粉4-8d后的幼果,常规消毒后,在无菌条件下切开果实,取出种子,小心分离出胚乳。
接种在培养基上,可用MS、White,加入2,4-D或NAA0.5-2.0mg/L,BAO.1-1.Omg/L。
在25-27℃和黑暗条件或散射光下培养,约6-lOd胚乳开始膨大,再培养形成愈伤组织.转到分化培养基上培养.
分化培养基可加入0.5-3.0mg/L的BA及少量的NAA。
待愈伤组织长出芽后,切下不定芽,插人生根培养基中,光下培养10-15d,切口处可长出白色的不定根。
升级会员 