免疫亲和柱高效液相色谱法测定饲料中的T2毒素.docx
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免疫亲和柱高效液相色谱法测定饲料中的T2毒素
免疫亲和柱-高效液相色谱荧光检测法测定饲料中的T-2毒素
林淼,赵志辉*,韩薇
(上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海201403)
摘要:
建立了免疫亲和柱净化-柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测器测定饲料中T-2毒素含量的方法。
样品经甲醇-水(体积比80:
20)提取,通过免疫亲和柱(IAC)净化,以氰酸蒽(1-AN)为衍生化试剂、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为催化剂进行衍生,C18色谱柱分离,荧光检测器检测,外标法定量。
结果表明:
T-2毒素的线性范围为10~200μg/L,加标回收率为76.9~92.1%,相对标准偏差(RSD)小于6%。
该方法可用于饲料中T-2毒素的测定。
关键词:
免疫亲和柱;柱前衍生化;高效液相色谱;饲料;T-2毒素
DeterminationofT-2ToxininfeedbyHighPerformanceLiquidChromatographywithFluorescenceDetectionafterimmunoaffinityColumnClean-Up
LINMiao,ZHAOZhi-hui*,HanWei
(InstituteforAgri-foodStandardsandTestingTechnology,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciencesy,Shanghai201403,China)
Abstract:
AmethodhasbeendevelopedforthedeterminationofT-2toxininfeedbyhighperformanceliquidchromatographywithfluorescencedetectionafterimmunoaffinitycolumnclean-upandprecolumnderivatization.Thederivatizationreactionwasusedtodevelopasensitive,reproducibleandaccuratemethodforthedeterminationofT-2toxininfeed.T-2toxinwasextractedwithmethanol-water(80∶20,v/v),purifiedbyimmunoaffinitycolumnscontainingantibodiesspecificforT-2toxin,andquantifiedbyreversedphasehighperformanceliquidchromatographywithfluorescencedetectionafterderivatizationwith1-anthroylnitrile(1-AN)
第一作者:
林淼(1981-),女,研究实习员,主要从事农产品检测研究。
E-mail:
linmiao0224@
通讯联系人:
赵志辉(1970-),男,研究员,主要从事农产品检测研究。
E-mail:
zhao9912@
基金项目:
1、国家标准《饲料中T-2毒素的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》编制说明,项目编号:
20091339-T-469,2、上海市科技兴农重点攻关项目,项目编号:
沪农科攻字(2009)第6-1号
and4-dimethylaminopyridine(DMAP).Theresultsshowthelinearrangeofcarnitineis10~200μg/L,therecoveryis76.9~92.1%,RSDisunder6%.ThemethodhasbeenappliedtothedeterminationofT-2toxininfeedwithsatisfactoryresult.
Keywords:
immunoaffinityprecolumnderivatization;highperformanceliquidchromatography;feed;T-2toxin
T-2毒素(T-2Toxin)是一种倍半萜烯化合物,学名为4β-1,5-二乙酰氧基-8α-(3-甲基丁酰氧基)-3α-羧基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯,为白色针状结晶,室温下稳定,烹调过程不易将其破坏[1];熔点为150~151℃;难溶于水;易溶于极性溶剂。
分子式为C24H34O9,相对分子质量为466.51[2],其结构式如图一。
T-2毒素是单端孢霉烯族毒素(trichothecenes)中危害最大的毒素之一,T-2毒素作为一种常见的真菌毒素,在自然界中广泛存在,主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物,人误食污染的谷物后,可引起呕吐、腹泻、发烧等中毒症状。
受T-2毒素污染的饲料可引发动物发生食欲不振,精神沉郁,唇、口腔黏膜溃疡和坏死,免疫功能下降,产蛋率下降,口腔和喙联合部黏膜坏死、结痂,舌和扁桃体肿大,对致病菌抵抗力减弱等症状,严重危害畜牧业的发展[3]。
目前,T-2毒素的测定方法主要有酶联免疫法[4,5](ELISA)、薄层色谱法[6](TLC)和液相色谱法[7](HPLC)。
TLC方法虽然分析成本较低,但操作过程烦琐,重复性差。
ELISA法操作简单,灵敏度高,但具有交叉反应,假阳性率比较高,定量不够准确。
目前国家标准中对于饲料的检测仅有薄层色谱法[6],此方法检出限较高,对轻、中度污染无法准确检测,不利于行业管理部门对T-2毒素污染的饲料产品进行有效管理,给用户和管理部门带来很大问题,本文建立了免疫亲和柱净化-柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测器测定饲料中T-2毒素含量的方法,此方法可以准确定量,并且检出限低。
图1 T-2毒素结构式
1试验部分
1.1方法原理
用甲醇和水的混合溶液提取试样中的T-2毒素,经免疫亲和柱净化,1-蒽腈衍生化后,用高效液相色谱荧光检测器测定,外标法定量。
1.2试剂与材料
1.2.1试剂
T-2毒素标准品:
纯度大于等于98%;甲醇:
色谱纯;乙腈:
色谱纯;甲苯:
色谱纯;4-二甲基氨基吡啶(DMAP):
称取0.0325g4-二甲基氨基吡啶,用甲苯溶解并定容至100mL;1-蒽腈:
称取0.030g1-蒽腈,用甲苯溶解并定容至100mL。
除特殊说明,所用试剂均为分析纯。
实验用水为超纯水。
1.2.2T-2毒素标准溶液
准确称取适量的T-2毒素标准品,用乙腈配成浓度为0.5mg/mL的标准储备液,-20℃冰箱中避光保存。
1.3仪器与设备
Waters2695高效液相色谱系统:
配有荧光检测器;超声波提取器;离心机:
3000r/min。
涡旋振荡器;氮吹仪:
可控温至50℃;注射器;空气压缩机。
1.4试验方法
1.4.1试样提取
准确称取磨碎混匀的试样50g(精确到0.01g)于500mL烧杯中,加入100mL甲醇-水(体积比为80:
20)混合溶剂,高速均质2min,转入离心管中,于4℃下以3000r/min的速率离心5min,上清液经定量滤纸过滤,移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀,用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,收集滤液。
1.4.2净化洗脱
将免疫亲和柱连接于10mL玻璃注射器下,准确移取10.0mL的上述提取液,注入注射器中。
将空气压缩机与注射器连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中。
再用10mL水淋洗免疫亲和柱,流速约为1滴/s~2滴/s,直至空气进入亲和柱中,弃去全部流出液,抽干小柱。
准确加入1.0mL甲醇洗脱,流速约为1滴/s,收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中,于50℃下用氮气吹干。
1.4.3衍生化
将上述净化后的样品分别加入50μL0.325g/L的DMAP和50μL0.3g/L的1-AN,在涡旋混合器上混匀1min,于50℃水浴反应15min,在冰水中冷却10min后取出,50℃下用氮气吹干,用1.0mL流动相溶解,待测。
2 结果与讨论
2.1提取条件优化
2.1.1提取剂的选择
由于T-2毒素的极性较高,因此在样品的提取阶段,选择适当极性的提取溶剂对提高回收率十分重要。
根据相似相容的原理,T-2毒素是水溶性的,原则上应该采用极性强或含水的极性溶剂来进行提取,而对于强极性物质的提取通常使用的溶剂为甲醇和乙腈。
在饲料样品中添加1μg/g的T-2毒素,比较了不同提取溶剂对测定结果的影响,结果见表1。
表1不同提取溶剂对测定结果的影响
提取剂(体积比)
回收率(%)
甲醇CH3OH
38.5
乙腈CH3CN
26.8
甲醇-水CH3OH-H2O(8∶2)
95.0
甲醇-水CH3OH-H2O(2∶8)
75.9
乙腈-水CH3CN-H2O(8∶2)
56.8
乙腈-水CH3CN-H2O(2∶8)
29.9
从表1中可见,乙腈或乙腈与水的混合溶液的回收率较低,而甲醇-水的回收率可达到75%以上,满足本方法的要求。
考虑到回收率和杂质干扰情况,当比例为80+20时效果最好,这主要是由于免疫亲和柱中的填料是具有生物活性的抗体,该抗体在乙腈中的生物活性极低(3~5%),而甲醇中相对要高一些,(15~20%),同时考虑甲醇的潜在毒性相对于乙腈要小一些,实验选择甲醇-水(体积比为80∶20)作为样品的提取试剂。
2.1.2提取方式的选择
在空白饲料样品中添加1μg/g的T-2毒素,静置一夜,采用振荡、超声、浸泡、高速均质方式分别进行提取。
回收率见表2。
从表中可以看出,除了浸泡外其他几种方法所得到的回收率均令人满意,但是高速均质的方式可以在最短时间内对T-2毒素进行有效提取,较其他方式有明显的优势,因此采用该方法进行提取。
表2提取方式的选择
方法/回收率
时间
2min
10min
30min
浸泡
26%
29%
39%
振荡
40%
76%
83%
超声
42%
75%
93%
均质
93%
94%
93%
2.2免疫亲和柱
免疫亲和柱是20世纪90年代在分析领域得到应用的一种新技术[8]。
它是以生物技术为基础,采用单克隆免疫亲和技术研制的一系列免疫亲和柱,具有高选择性和抗干扰性,是目前国际上较为常用的检测真菌毒素样品的前处理方法之一。
与其他净化方法(如液-液萃取等)相比,IAC柱以特效性的单克隆抗体免疫技术为分离手段,可以将真菌毒素分离、净化,并且选择性强,净化效果好。
试验中选择美国维康(Vicam)公司的T-2TAGTM免疫亲和柱净化待测样品,待测组分T-2毒素被单一吸附,可有效消除杂质的干扰。
2.3衍生化条件的选择
2.3.1衍生试剂和催化剂的选择
1-蒽腈(1-anthroylnitrile,1-AN)是一种具有荧光特性的试剂,它取代T-2毒素分子中羟基上的一个氢而生成一种具有很强荧光特性的物质,在荧光检测器下有很灵敏的响应。
4-二甲基氨基吡啶(DMAP)作为一种催化剂可以使此衍生化顺利进行,并且能获得稳定的T-2毒素衍生物[2]。
2.3.2反应条件的选择
温度和反应时间对衍生化反应的影响很大。
在样品中添加20μg/kg的T-2毒素,衍生化反应温度分别控制在20-80℃,间隔10℃;同时每个温度设置反应时间5