免疫亲和柱高效液相色谱法测定饲料中的T2毒素.docx

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免疫亲和柱高效液相色谱法测定饲料中的T2毒素

免疫亲和柱-高效液相色谱荧光检测法测定饲料中的T-2毒素

林淼，赵志辉*，韩薇

（上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海201403）

摘要:

建立了免疫亲和柱净化-柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测器测定饲料中T-2毒素含量的方法。

样品经甲醇-水（体积比80：

20）提取，通过免疫亲和柱（IAC）净化，以氰酸蒽（1-AN）为衍生化试剂、4-二甲基氨基吡啶（DMAP）为催化剂进行衍生，C18色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。

结果表明：

T-2毒素的线性范围为10~200μg/L，加标回收率为76.9~92.1%，相对标准偏差（RSD）小于6%。

该方法可用于饲料中T-2毒素的测定。

关键词:

免疫亲和柱；柱前衍生化；高效液相色谱；饲料；T-2毒素

DeterminationofT-2ToxininfeedbyHighPerformanceLiquidChromatographywithFluorescenceDetectionafterimmunoaffinityColumnClean-Up

LINMiao，ZHAOZhi-hui*，HanWei

（InstituteforAgri-foodStandardsandTestingTechnology,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciencesy,Shanghai201403,China）

Abstract：

AmethodhasbeendevelopedforthedeterminationofT-2toxininfeedbyhighperformanceliquidchromatographywithfluorescencedetectionafterimmunoaffinitycolumnclean-upandprecolumnderivatization.Thederivatizationreactionwasusedtodevelopasensitive,reproducibleandaccuratemethodforthedeterminationofT-2toxininfeed.T-2toxinwasextractedwithmethanol-water（80∶20,v/v）,purifiedbyimmunoaffinitycolumnscontainingantibodiesspecificforT-2toxin,andquantifiedbyreversedphasehighperformanceliquidchromatographywithfluorescencedetectionafterderivatizationwith1-anthroylnitrile（1-AN）

第一作者：

林淼（1981－），女，研究实习员，主要从事农产品检测研究。

E－mail:

linmiao0224@

通讯联系人：

赵志辉（1970－），男，研究员，主要从事农产品检测研究。

E－mail:

zhao9912@

基金项目：

1、国家标准《饲料中T-2毒素的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》编制说明，项目编号：

20091339-T-469,2、上海市科技兴农重点攻关项目，项目编号：

沪农科攻字（2009）第6-1号

and4-dimethylaminopyridine（DMAP）.Theresultsshowthelinearrangeofcarnitineis10~200μg/L,therecoveryis76.9~92.1%,RSDisunder6%.ThemethodhasbeenappliedtothedeterminationofT-2toxininfeedwithsatisfactoryresult.

Keywords：

immunoaffinityprecolumnderivatization;highperformanceliquidchromatography;feed;T-2toxin

T-2毒素（T-2Toxin）是一种倍半萜烯化合物，学名为4β-1,5-二乙酰氧基-8α-（3-甲基丁酰氧基）-3α-羧基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯，为白色针状结晶,室温下稳定,烹调过程不易将其破坏[1]；熔点为150～151℃；难溶于水；易溶于极性溶剂。

分子式为C24H34O9,相对分子质量为466.51[2]，其结构式如图一。

T-2毒素是单端孢霉烯族毒素（trichothecenes）中危害最大的毒素之一，T-2毒素作为一种常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在，主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物，人误食污染的谷物后，可引起呕吐、腹泻、发烧等中毒症状。

受T-2毒素污染的饲料可引发动物发生食欲不振，精神沉郁，唇、口腔黏膜溃疡和坏死，免疫功能下降，产蛋率下降，口腔和喙联合部黏膜坏死、结痂，舌和扁桃体肿大，对致病菌抵抗力减弱等症状，严重危害畜牧业的发展[3]。

目前，T-2毒素的测定方法主要有酶联免疫法[4,5]（ELISA）、薄层色谱法[6]（TLC）和液相色谱法[7]（HPLC）。

TLC方法虽然分析成本较低，但操作过程烦琐，重复性差。

ELISA法操作简单，灵敏度高，但具有交叉反应，假阳性率比较高，定量不够准确。

目前国家标准中对于饲料的检测仅有薄层色谱法[6]，此方法检出限较高，对轻、中度污染无法准确检测，不利于行业管理部门对T-2毒素污染的饲料产品进行有效管理，给用户和管理部门带来很大问题，本文建立了免疫亲和柱净化-柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测器测定饲料中T-2毒素含量的方法，此方法可以准确定量，并且检出限低。

图1　T-2毒素结构式

1试验部分

1.1方法原理　

用甲醇和水的混合溶液提取试样中的T-2毒素，经免疫亲和柱净化，1-蒽腈衍生化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。

1.2试剂与材料

1.2.1试剂

T-2毒素标准品：

纯度大于等于98%；甲醇：

色谱纯；乙腈：

色谱纯；甲苯：

色谱纯；4-二甲基氨基吡啶（DMAP）：

称取0.0325g4-二甲基氨基吡啶，用甲苯溶解并定容至100mL；1-蒽腈：

称取0.030g1-蒽腈，用甲苯溶解并定容至100mL。

除特殊说明，所用试剂均为分析纯。

实验用水为超纯水。

1.2.2T-2毒素标准溶液

准确称取适量的T-2毒素标准品，用乙腈配成浓度为0.5mg/mL的标准储备液，-20℃冰箱中避光保存。

1.3仪器与设备

Waters2695高效液相色谱系统：

配有荧光检测器；超声波提取器；离心机：

3000r/min。

涡旋振荡器；氮吹仪：

可控温至50℃；注射器；空气压缩机。

1.4试验方法

1.4.1试样提取

准确称取磨碎混匀的试样50g（精确到0.01g）于500mL烧杯中，加入100mL甲醇-水（体积比为80：

20）混合溶剂，高速均质2min，转入离心管中，于4℃下以3000r/min的速率离心5min，上清液经定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液于50mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液。

1.4.2净化洗脱

将免疫亲和柱连接于10mL玻璃注射器下，准确移取10.0mL的上述提取液，注入注射器中。

将空气压缩机与注射器连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。

再用10mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1滴/s~2滴/s，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。

准确加入1.0mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，于50℃下用氮气吹干。

1.4.3衍生化　

将上述净化后的样品分别加入50μL0.325g/L的DMAP和50μL0.3g/L的1-AN，在涡旋混合器上混匀1min，于50℃水浴反应15min，在冰水中冷却10min后取出，50℃下用氮气吹干，用1.0mL流动相溶解，待测。

2　结果与讨论

2.1提取条件优化

2.1.1提取剂的选择

由于T-2毒素的极性较高，因此在样品的提取阶段，选择适当极性的提取溶剂对提高回收率十分重要。

根据相似相容的原理，T-2毒素是水溶性的，原则上应该采用极性强或含水的极性溶剂来进行提取，而对于强极性物质的提取通常使用的溶剂为甲醇和乙腈。

在饲料样品中添加1μg/g的T-2毒素，比较了不同提取溶剂对测定结果的影响，结果见表1。

表1不同提取溶剂对测定结果的影响

提取剂（体积比）

回收率（%）

甲醇CH3OH

38.5

乙腈CH3CN

26.8

甲醇-水CH3OH-H2O（8∶2）

95.0

甲醇-水CH3OH-H2O（2∶8）

75.9

乙腈-水CH3CN-H2O（8∶2）

56.8

乙腈-水CH3CN-H2O（2∶8）

29.9

从表1中可见,乙腈或乙腈与水的混合溶液的回收率较低，而甲醇-水的回收率可达到75%以上，满足本方法的要求。

考虑到回收率和杂质干扰情况,当比例为80+20时效果最好，这主要是由于免疫亲和柱中的填料是具有生物活性的抗体，该抗体在乙腈中的生物活性极低（3~5%），而甲醇中相对要高一些，（15~20%），同时考虑甲醇的潜在毒性相对于乙腈要小一些，实验选择甲醇-水（体积比为80∶20）作为样品的提取试剂。

2.1.2提取方式的选择

在空白饲料样品中添加1μg/g的T-2毒素，静置一夜，采用振荡、超声、浸泡、高速均质方式分别进行提取。

回收率见表2。

从表中可以看出，除了浸泡外其他几种方法所得到的回收率均令人满意，但是高速均质的方式可以在最短时间内对T-2毒素进行有效提取，较其他方式有明显的优势，因此采用该方法进行提取。

表2提取方式的选择

方法/回收率

时间

2min

10min

30min

浸泡

26%

29%

39%

振荡

40%

76%

83%

超声

42%

75%

93%

均质

93%

94%

93%

2.2免疫亲和柱

免疫亲和柱是20世纪90年代在分析领域得到应用的一种新技术[8]。

它是以生物技术为基础,采用单克隆免疫亲和技术研制的一系列免疫亲和柱，具有高选择性和抗干扰性,是目前国际上较为常用的检测真菌毒素样品的前处理方法之一。

与其他净化方法（如液-液萃取等）相比,IAC柱以特效性的单克隆抗体免疫技术为分离手段,可以将真菌毒素分离、净化，并且选择性强，净化效果好。

试验中选择美国维康（Vicam）公司的T-2TAGTM免疫亲和柱净化待测样品，待测组分T-2毒素被单一吸附，可有效消除杂质的干扰。

2.3衍生化条件的选择

2.3.1衍生试剂和催化剂的选择

1-蒽腈（1-anthroylnitrile,1-AN）是一种具有荧光特性的试剂，它取代T-2毒素分子中羟基上的一个氢而生成一种具有很强荧光特性的物质,在荧光检测器下有很灵敏的响应。

4-二甲基氨基吡啶（DMAP）作为一种催化剂可以使此衍生化顺利进行，并且能获得稳定的T-2毒素衍生物[2]。

2.3.2反应条件的选择

温度和反应时间对衍生化反应的影响很大。

在样品中添加20μg/kg的T-2毒素,衍生化反应温度分别控制在20-80℃，间隔10℃；同时每个温度设置反应时间5