免疫亲和柱高效液相色谱法测定饲料中的T2毒素.docx

1、免疫亲和柱高效液相色谱法测定饲料中的T2毒素免疫亲和柱-高效液相色谱荧光检测法测定饲料中的T-2毒素林淼，赵志辉*，韩薇（上海市农业科学院 农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403）摘 要: 建立了免疫亲和柱净化-柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测器测定饲料中T-2毒素含量的方法。样品经甲醇-水（体积比80：20）提取，通过免疫亲和柱（IAC）净化，以氰酸蒽（1-AN）为衍生化试剂、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)为催化剂进行衍生，C18色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。结果表明：T-2毒素的线性范围为10200 g/L，加标回收率为76.992.1%，相对标准偏差(RSD)小于6

2、 %。该方法可用于饲料中T-2毒素的测定。关键词: 免疫亲和柱；柱前衍生化；高效液相色谱；饲料；T-2毒素Determination of T-2 Toxin in feed by High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection after immunoaffinity Column Clean-UpLIN Miao，ZHAO Zhi-hui*，Han Wei(Institute for Agri-food Standards and Testing Technology, Shanghai Academy

3、of Agricultural Sciencesy, Shanghai 201403, China)Abstract：A method has been developed for the determination of T-2 toxin in feed by high performance liquid chromatography with fluorescence detection after immunoaffinity column clean-up and precolumn derivatization. The derivatization reaction was u

4、sed to develop a sensitive, reproducible and accurate method for the determination of T-2 toxin in feed. T-2 toxin was extracted with methanol-water (8020, v / v) , purified by immunoaffinity columns containing antibodies specific for T-2 toxin, and quantified by reversed phase high performance liqu

5、id chromatography with fluorescence detection after derivatization with 1-anthroylnitrile ( 1-AN ) 第一作者：林淼（1981），女，研究实习员，主要从事农产品检测研究。Email:linmiao0224通讯联系人：赵志辉（1970），男，研究员，主要从事农产品检测研究。Email: zhao9912基金项目：1、国家标准饲料中T-2毒素的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法编制说明，项目编号：20091339-T-469,2、上海市科技兴农重点攻关项目，项目编号：沪农科攻字（2009）第6-1号a

6、nd 4-dimethylam inopyridine (DMAP). The results show the linear range of carnitine is 10200g/L, the recovery is 76.992.1%, RSD is under 6 %. The method has been applied to the determination of T-2 toxin in feed with satisfactory result.Keywords：immunoaffinity precolumn derivatization; high performan

7、ce liquid chromatography; feed; T-2 toxinT-2毒素（T-2 Toxin)是一种倍半萜烯化合物，学名为4-1, 5-二乙酰氧基-8- (3-甲基丁酰氧基) -3-羧基-12, 13-环氧单端孢霉-9-烯，为白色针状结晶, 室温下稳定, 烹调过程不易将其破坏1；熔点为150151 ；难溶于水；易溶于极性溶剂。分子式为C24 H34 O9 , 相对分子质量为466.51 2，其结构式如图一。T-2 毒素是单端孢霉烯族毒素(trichothecenes)中危害最大的毒素之一，T-2 毒素作为一种常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在，主要污染小麦、大麦、玉米等粮食

8、作物，人误食污染的谷物后，可引起呕吐、腹泻、发烧等中毒症状。受T-2毒素污染的饲料可引发动物发生食欲不振，精神沉郁，唇、口腔黏膜溃疡和坏死，免疫功能下降，产蛋率下降，口腔和喙联合部黏膜坏死、结痂，舌和扁桃体肿大，对致病菌抵抗力减弱等症状，严重危害畜牧业的发展3。目前，T-2毒素的测定方法主要有酶联免疫法4,5 (ELISA)、薄层色谱法6 (TLC)和液相色谱法7 (HPLC)。TLC方法虽然分析成本较低，但操作过程烦琐，重复性差。ELISA 法操作简单，灵敏度高，但具有交叉反应，假阳性率比较高，定量不够准确。目前国家标准中对于饲料的检测仅有薄层色谱法6，此方法检出限较高，对轻、中度污染无法准

9、确检测，不利于行业管理部门对T-2毒素污染的饲料产品进行有效管理，给用户和管理部门带来很大问题，本文建立了免疫亲和柱净化-柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测器测定饲料中T-2毒素含量的方法，此方法可以准确定量，并且检出限低。图1 T-2毒素结构式1 试验部分1.1方法原理用甲醇和水的混合溶液提取试样中的T-2毒素，经免疫亲和柱净化，1-蒽腈衍生化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。1.2试剂与材料1.2.1 试剂T-2毒素标准品：纯度大于等于98%；甲醇：色谱纯；乙腈：色谱纯；甲苯：色谱纯；4-二甲基氨基吡啶(DMAP)：称取0.0325 g 4-二甲基氨基吡啶，用甲苯溶解并定容至10

10、0 mL；1-蒽腈：称取0.030 g 1-蒽腈，用甲苯溶解并定容至100 mL。除特殊说明，所用试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。1.2.2 T-2毒素标准溶液准确称取适量的T-2毒素标准品，用乙腈配成浓度为0.5 mg/mL的标准储备液，-20冰箱中避光保存。1.3 仪器与设备Waters 2695高效液相色谱系统：配有荧光检测器；超声波提取器；离心机：3000r/min。涡旋振荡器；氮吹仪：可控温至50；注射器；空气压缩机。1.4 试验方法1.4.1 试样提取 准确称取磨碎混匀的试样50 g（精确到0.01 g）于500 mL烧杯中，加入100 mL甲醇-水（体积比为80：20）混合溶剂

11、，高速均质2 min，转入离心管中，于4下以3000 r/min的速率离心5 min，上清液经定量滤纸过滤，移取10.0 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液。1.4.2 净化洗脱 将免疫亲和柱连接于10 mL玻璃注射器下，准确移取10.0 mL的上述提取液，注入注射器中。将空气压缩机与注射器连接，调节压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。再用10 mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1滴/s2滴/s，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。准确加入1.0 mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s，收集全部洗脱液于干净

12、的玻璃试管中，于50下用氮气吹干。1.4.3 衍生化将上述净化后的样品分别加入50 L 0.325g/L的DMAP和50 L 0.3g/L的1-AN，在涡旋混合器上混匀1 min，于50水浴反应15 min，在冰水中冷却10 min后取出，50下用氮气吹干，用1.0 mL流动相溶解，待测。2 结果与讨论2.1 提取条件优化2.1.1 提取剂的选择由于T-2毒素的极性较高，因此在样品的提取阶段，选择适当极性的提取溶剂对提高回收率十分重要。根据相似相容的原理，T-2毒素是水溶性的，原则上应该采用极性强或含水的极性溶剂来进行提取，而对于强极性物质的提取通常使用的溶剂为甲醇和乙腈。在饲料样品中添加1g

13、 / g的T-2毒素，比较了不同提取溶剂对测定结果的影响，结果见表1。表1 不同提取溶剂对测定结果的影响提取剂（体积比）回收率(%)甲醇CH3OH38.5乙腈CH3CN26.8甲醇-水CH3OH-H2O (82)95.0甲醇-水CH3OH-H2O (28)75.9乙腈-水CH3CN-H2O (82)56.8乙腈-水CH3CN-H2O (28)29.9从表1 中可见, 乙腈或乙腈与水的混合溶液的回收率较低，而甲醇-水的回收率可达到75%以上，满足本方法的要求。考虑到回收率和杂质干扰情况, 当比例为80+20时效果最好，这主要是由于免疫亲和柱中的填料是具有生物活性的抗体，该抗体在乙腈中的生物活性极

14、低（35%），而甲醇中相对要高一些，（1520%），同时考虑甲醇的潜在毒性相对于乙腈要小一些，实验选择甲醇- 水(体积比为8020)作为样品的提取试剂。2.1.2 提取方式的选择在空白饲料样品中添加1g/g的T-2毒素，静置一夜，采用振荡、超声、浸泡、高速均质方式分别进行提取。回收率见表2。从表中可以看出，除了浸泡外其他几种方法所得到的回收率均令人满意，但是高速均质的方式可以在最短时间内对T-2毒素进行有效提取，较其他方式有明显的优势，因此采用该方法进行提取。表2 提取方式的选择方法/回收率时间2min10min30min浸泡26%29%39%振荡40%76%83%超声42%75%93%均质9

15、3%94%93%2.2 免疫亲和柱免疫亲和柱是20世纪90年代在分析领域得到应用的一种新技术8。它是以生物技术为基础, 采用单克隆免疫亲和技术研制的一系列免疫亲和柱，具有高选择性和抗干扰性, 是目前国际上较为常用的检测真菌毒素样品的前处理方法之一。与其他净化方法(如液-液萃取等)相比, IAC柱以特效性的单克隆抗体免疫技术为分离手段, 可以将真菌毒素分离、净化，并且选择性强，净化效果好。试验中选择美国维康(Vicam)公司的T-2 TAGTM免疫亲和柱净化待测样品，待测组分T-2毒素被单一吸附，可有效消除杂质的干扰。2.3 衍生化条件的选择2.3.1衍生试剂和催化剂的选择1-蒽腈（1-anthroylnitrile,1-AN）是一种具有荧光特性的试剂，它取代T-2毒素分子中羟基上的一个氢而生成一种具有很强荧光特性的物质, 在荧光检测器下有很灵敏的响应。4-二甲基氨基吡啶( DMAP)作为一种催化剂可以使此衍生化顺利进行，并且能获得稳定的T-2毒素衍生物2。2.3.2反应条件的选择温度和反应时间对衍生化反应的影响很大。在样品中添加20g / kg的T-2毒素, 衍生化反应温度分别控制在20-80 ，间隔10；同时每个温度设置反应时间5