细胞因子检测最新版.docx

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细胞因子检测最新版

细胞因子检测

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质，在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动，在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用。

某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病的发病及病理过程。

1、免疫学检测法其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。

如免疫斑点法、ＥLISA法、RIＡ法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测.

2.、生物学测定法其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株（即靶细胞）的促增殖作用,以增殖细胞中的ＤNA的合成或酶活性为指标，间接推算出细胞因子的活性单位，如对IL-1、IL—2等细胞因子活性的检测。

亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定....感谢聆听...

3、分子生物学测定法　目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR等。

通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRＮA量，推算出细胞因子的合成量。

一、IL—1的检测（生物活性测定）

产生IL－1的细胞种类很多,其中最主要的为单核－巨噬细胞.IL－１可分为ＩＬ—1α（也称酸性IＬ-1,ｐI＝5.０）和IL－１β（中性ＩL-１，pＩ=7.0）。

两者的分子量和生物活性相似,只能用抗体检测方法才能区别，常用的生物学测定法对两者都适用。

IL－１的生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G4。

1细胞增殖法及Ｌ９29细胞增殖法等。

ＩL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数，3Ｈ-ＴｄR或12５Ｉ—UｄR的DNA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。

本试验介绍L929细胞增殖MTT比色法....感谢聆听...

（一）IL—1的诱生

体外试验可用LPS等有丝分裂原诱导单核－巨噬细胞产生IL－１，或用P388D１（鼠），THP-1（人）细胞株制备IＬ－1。

本试验以小鼠巨噬细胞制备IL-1.

1、取6~10周龄BALＢ/c或C5７BL/６小鼠,雌雄均可，拉颈处死后用酒精消毒。

2、用带９号针头的5ml注射器腹腔注入5ml冷的含5%小牛血清的Hａnks液（５％NBS—HBSＳ）,轻揉腹部吸出腹腔液体（内含腹腔细胞）,反复抽吸几次.

３、15０0r/miｎ离心8min，洗细胞2次。

4、将腹腔细胞用含１0％小牛血清的RＰMI-16４0液（1０％ＮBS-RＰＭＩ-１640）配成2×106／ml,加到2４孔平底培养板,1mｌ/孔,置5％CO２，37℃温箱孵育2h。

5、每孔用５％　ＮＢＳ—HBSＳ洗３次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为巨噬细胞单层。

6、将ＬＰＳ（１0μg／ml）加入巨噬细胞单层,每孔1ml，培养4h;加入10％NBS-16４0１ml继续培养至48h,收集上清液,置—20℃冰箱保存，待测IL-1活性及含量。

（二）L９29细胞增殖MTT比色法

MTT比色分析法的原理是利用四甲基偶氮唑盐[３－（4。

5-dimethylthiａzｏｌ—2—ｙ１）－2,5—diｐhenylteｔrazｏliumbromide，MTT）在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成兰黑色的MTT—甲，形成MTT-甲的量与细胞增殖程度呈正相关。

故通过测定细胞形成MTT—甲　量，可间接定量分析细胞的增殖情况，具体步骤如下：

...感谢聆听...

1、将生长成单层的L９２9细胞用０.25％胰酶消化２~3miｎ。

除去消化液后，用10％ＦＣＳ的RPMＩ—１６4０将L92９细胞配成1×１0５/ml，加入９6孔细胞培养板中,每孔10０μｌ。

2、取100μl不同稀释度的IL-1标准品和待测品，分别加入各孔中，每孔设3个复孔,置37℃,5%ＣO2温箱孵育56h.

３、用ＰBS溶解MTT为５mg／ｍｌ，用0。

22μm膜滤器除菌及杂质。

4、上述培养体系取出后，每孔加入10μlMTT（5mｇ／ml）,37℃继续培养４h.

５、从每孔吸出100μｌ上清弃去,加酸化异丙醇或加DMSＯ100μl/孔,充分混匀以溶解底物。

酸性条件使培养液中酚红指示剂变为黄色，以利于对MTＴ—甲转化物的测定。

6、将微量测定板置室温数分钟,保证转变的底物结晶被溶解。

７、用酶标光度计以检测波长为570nm,参考波长为６30nm分别测量ＯD值。

测定应在酸化异丙醇加入后1ｈ内完成。

OD57０nm－OＤ６3０nm,再减去培养液对照的OD值.

8、用ＩL-１标准品各稀释度IＬ—1含量（X）和各稀释度对应的ＯD值（Y）作直线回归,按上述概率单位分析法计算待测样品IL-2的活性单位（u/ml）。

（三）注意事项

１、IL—1诱生剂的浓度,培养条件和细胞浓度对结果均有明显影响，应进行预试验以确定最佳实验条件。

2、培养器皿和研磨条件:

24孔培养板培养细胞活率较高，但生长稍慢。

玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净引起细胞死亡，故应注意采取相应措施。

大量培养时用大容量瓶比较方便,可减少操作中的污染。

研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网.

二、ＴNF的检测（免疫学测定法，双抗体ELＩSA夹心法）

（一）原理　选用两种针对ｒHuＴNＦ—α分子不同表位的单克隆抗体,一种单克隆抗体作为包被抗体,另一种单克隆抗体作为酶标抗体,如果待测样品中含有TＮF－α，则形成抗体-TＮF-α－酶标抗体复合物,通过酶催化底物显色，亦可根据标准品OD值绘制标准曲线,从标准曲线上查出待检标本中TNF－α的含量。

...感谢聆听...

（二）材料和试剂

1、包被抗体：

使用时用包被缓冲液作适当稀释。

２、酶标抗体：

　使用时用稀释液作适当稀释.

3、标准品:

ｒHuTＮF-α（１0nｇ/mｌ），使用时用稀释液作倍比稀释。

４、阴性对照液（未免疫鼠Iｇ）。

5、ABTＳ底物:

２，2’—Aziｎo—ｂis-（3-eｈtｙlbｅnzthｉozoｌiｎｅ　６－suｌfoｎｉcacｉd）,2,２'-连氮基-双（3－乙基苯并噻吡咯呆-６磺酸）。

６、96孔ELＩSA板。

７、0．15mol／L,pH7。

4PＢS：

配其它液体用。

８、包被缓冲液：

0．05mol/L，pH９.6Nａ２ＣO3-NaHCＯ3缓冲液。

9、洗涤液：

　0。

０５%Tweeｎ20—PBS。

10、稀释液:

4％PＥG-洗涤液（用于稀释标准品和酶标抗体）。

11、底物缓冲液:

0．1mol／L，pＨ5。

0柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液。

12、3%H2O2。

13、血清、枸缘酸盐或ＥDTＡ抗酸血浆、其它体液及细胞培养上清均可检测,后者应作适当稀释.

14、ELＩSＡ读数仪等.

（三）操作步骤

１、包被　将稀释好的包被抗体加入ELIＳA板,100μl/孔，4％放置24ｈ或４8h。

2、加待检标本洗涤液冲洗EＬISＡ板3次,加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品,100μl/孔,37％，1h。

标准品稀释方法：

取标准品１50μｌ（1０ng／mｌ）倍比稀释7个浓度:

５ng/mｌ、２.5ng／ml、1.25ng/ml、６２5pg/mｌ、312pg／ml、1５６pg/ml和78pg／ml。

3、加酶标抗体：

洗板3次,加入稀释好的酶标抗体，１0０μｌ/孔，３7℃,1h。

４、显色：

洗板3次，加入配好的ABTS显色液，100μl/孔，室温或3７℃显色１５～３０miｎ。

5、ELIＳＡ读数仪测410ｎm处ＯD值,绘制标准曲线.

6、从标准曲线查得待测样品中的TＮF—α含量。

四、注意事项

1、血清或血浆中残存凝块或红细胞须经离心去除，勿用溶血或脂肪过多的血清。

2、标本在2～8℃可储存3天，超过3天应放入-20℃或-70℃,避免反复冻融.

3、分别用加样器头吸取各份标本,避免相互交叉。

４、叠氮钠（NaN３）对辣根过氧化物酶（HRP）有灭活作用，在本实验系统中应避免使用.

5、底物显色液必须临用时配制，双氧水应放置在2~８℃，保存6个月以内。

附：

试剂配制

1。

　0.15mｏl/Ｌ，pH7。

4ＰBS

KＨ2PO40.2g

Na2HPO4·12H2Ｏ2.9ｇ

NaＣl8.0g

KＣl0.2ｇ

双蒸水加至100ｍｌ

2．包被缓冲液

Ｎa2CO3　1．５9g

NaHCO3　２。

9３g

双蒸水加至1000mｌ

3.　洗涤液

PBS　1００0mｌ

Ｔｗeen　20０.5ml

４。

稀释液

洗涤液１00ml

鸡蛋清0.6ml

PEG（聚乙二醇,MW６0００）2。

0ｇ

NaＣl　2。

9g

５．　底物缓冲液

Ｎa2HPO４·12H２Ｏ１．79g

拧檬酸1．29ｇ

双蒸水加至　100ml

6.ABＳ显色液

ＡBTS５mｇ

底物缓冲液10ml

3％Ｈ２O２2０μｌ

三、IL—2的检测（基因的检测）

细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和mRNA表达的检测，常用的方法有Southern印迹，斑点印迹,PCR，原位杂交及原位PCＲ等，Nｏrｔhern印迹及RT—PCR。

本文介绍IL—2mRNＡ的测定（斑点杂交法）.将ＲNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上，可用手工操作点样,也可用斑点式点样器点样，再与特异性探针进行杂交。

本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。

由于其操作比Ｎorｔheｒn印迹简单、迅速，所需样品量少,且可在同一张膜上同时进行多个样品的检测，故很适合于临床应用.亦可用于ＤNA的检测。

但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量。

...感谢聆听...

（一）主要试剂

１．ＲNＡ提取试剂:

TRIZOＬ试剂（Giｂcol，Ｎo.15596－026）,DEPＣ水（Flｕka,No。

９8０２１0）

2.质粒提取试剂盒:

（Pｒomegａ:

WizａrdMiniprepｓDNA,Nｏ.117）

3.DＮA片段提取试剂盒：

（LaJｏlla）

4。

地高辛标记和检测试剂盒:

（Boerhｉｎｇeｒ　Mannheiｍ，No．１09365７）

5.IＬ－2ＤNA探针

6。

其他试剂

（1）STE溶液０．1ｍｏl/Ｌ　NaCl

10ｍmol/LＴrｉs。

Cｌ（pH8。

0）

1mmｏl／LEDTA（pH8．0）

（2）溶液Ⅰ5０mmol/L葡萄糖

25mmol/LTｒｉｓ。

Cｌ（ｐＨ8．０）

1０mmｏl/L　ＥDTA（pH8．0）

可配100mｌ，高压灭菌15mｉn，贮存于4℃

（3）溶液Ⅱ0。

２mol／ＬＮaOＨ（临用前用10mｏl/L贮存液稀释）

１％ＳDS（配20％贮存液）

盖紧瓶盖,颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。

于室温放置5～10mｉn

（4）　溶液Ⅲ　5mol/L　乙酸钾６0ml

冰乙酸１１.5ml

水２８.5mｌ

所配成的溶液对钾是3moｌ/Ｌ，对乙酸根是5mｏｌ/L

（５）　含相应抗生素的ＬＢ培养基

（6）氯霉素（０.２５ｇ/2ml）－--〉终浓度170μg/ml

（7）　溶菌酶（10mg/ml,溶于10mｍol/LTrｉs.ＣlpH8．0）1ｍl

（８）　无水乙醇（部分—20℃预冷）.异丙醇．75%乙醇（部分４℃预冷）

（9）　TE缓冲液（pＨ8.0）

（10）5mｏl/LLiＣl1。

5ml

（11）RNＡ酶，ＲPMI－16４0,胎牛血清（FCS），CｏnA（刀豆蛋白Ａ）等

（1２）500μl　含13％（W/V）聚乙二醇（ＰEG８00）的１．6mol/LNaCl

（13）3mol/LNaAc、饱和酚、氯仿:

异戊醇（24：

1）

（二）主要仪器

ＣO2培养箱：

美国ForｍaScieｎtｉfic产品；

无菌操作台:

苏州净化设备公司产品；

图象处理分析仪：

同济医大太阳公司产品；

低温高速离心机:

上海离心机械研究所．

（三）IＬ－2质粒DNＡ探针的大量制备

1、含IL—2质粒DNA探针的提取

取含IL—２质粒ＤNＡ的单个菌落置两个25ml　ＬＢ培养基（含100μｇ/ml　Amp）

↓37℃　２2０r/ｍin振摇过夜（约16h）

取１0mｌ菌液加200ml　ＬＢ培养液（含100μg/mlＡmp）

↓37℃　１５0r/min　振摇４h

加氯霉素（终浓度170μｇ/ml）

↓３7℃220r／min　振摇３ｈ

菌液倒入300mｌ离心管中离心

↓４℃50０0r/mｉn×1０min离心弃上清除去残液（吸水纸无菌）

每管加40ml　SＴE溶液（冰预冷）悬浮细菌后,用移液管转入到５0ml离心管中

↓４℃5０00r×15miｎ离心

弃上清,加5ml溶液Ⅰ（冰预冷）悬浮细菌，加1ｍl新配制（pH8．0）的溶菌酶（10mg/ｍl）

↓轻摇，室温静置5ｍin

加１０ml溶液Ⅱ，盖上盖子,将离心管小心颠倒数次混匀液体,不要用旋涡振荡器

↓冰浴10min，且勿摇动

加7。

５ml溶液Ⅲ（冰预冷），轻振荡离心管数次使之混合

↓冰浴2０~３0min，使沉淀完全,４℃　1２０00r/min×20min离心

取上清到另一50mｌ离心管中,加0.6体积异丙醇，混匀，室温静置15mｉn

↓室温５000r/ｍin×15min离心弃上清

用7５％乙醇洗涤沉淀一次（不将沉淀悬浮）,倒出乙醇，倒置吸水纸上，使乙醇挥发

用1。

５mｌTE（pH8.0）将沉淀溶解，加等体积冰预冷的5MLiCｌ,混匀后置冰浴10miｎ

↓4℃1200０ｒ/min×１0min离心

取上清至新EP管，加等体积的异丙醇（约3ml）,充分混匀，室温静置1５min

↓室温12000rｍin×10miｎ离心（回收沉淀的核酸）

小心去上清，将管倒置以使最后残留的液滴流尽,用75%乙醇洗涤沉淀，流尽乙醇,用吸纸吸去附于管壁的液滴,将管倒置在纸巾上数分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发

用50０μlTE（ｐH8.0）溶解DNA沉淀,移至新EP管中，加入ＲＮA酶（终浓度1００μｇ/mｌ）

↓37℃水浴30min

加等体积（500μl）含1３％（W／V）PEG（8０0）的　1.6ｍｏl／LＮaCｌ，充分混合

↓４℃１200０r／mｉn×５min离心

吸去上清，用400μlTE（pH8.0）溶解质粒DNA沉淀

加等体积饱和酚（400μl）混合

↓１200０r/ｍiｎ×１0mｉｎ离心

吸上层水相移至另一ＥP管，加入等体积酚：

氯仿：

异戊醇（２5：

2４:

1）剧烈混匀呈乳白状

↓１2０00r/mｉｎ×10min离心

吸上层水相移至另一EP管，加等体积氯仿：

异戊醇（24:

1）混匀

↓１2000r/min×1０min离心

吸上层水相移至新EP管（硅化），加入0．1体积的3mｏｌ/L　NａAｃ（ｐH5.2）和2体积的—20℃预冷的无水乙醇，混匀（可见沉淀出现），置-20℃2h或0℃　2０min

↓4℃12000ｒ/min×１5min离心

弃上清，加75％乙醇（4℃预冷）200μｌ,稍加振荡，离心洗涤２次

↓4℃　12000r/mｉn×５ｍiｎ离心去上清

敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽

溶沉淀于１1μlTE溶液中

↓　↓

取1μl电泳　其余进行酶切

２。

、经0.7％琼脂凝胶电泳，确定有质粒DNA后,用XhoＩ进行酶切。

酶切反应体系：

质粒DＮＡ1０μl

XhoI6μl

10*Ｂufｆer（H）6μl

ＤＷ38μｌ

—---——－-－--－－-—--——-－--

总体积60μｌ　37℃消化过夜

3。

　用WizａrｄTMPCR纯化试剂盒回收IL—２　DNA片段

1）将60μl酶切反应体系经１%琼脂糖凝胶电泳

2）紫外灯下切下IL—2ＤNA片段,挑出凝胶到EP管中,加1mlResin使凝胶溶化

3）用５ml一次性注射器将Rｅsin/DNＡmiｘ转移到WｉzａrｄＴM　Miniｃolumn中，用2ｍl80％异丙醇洗涤Ｍｉnicoluｍ,1２００0g离心2０s，加50μlDW到Ｍｉnicolumn中,12０00g离心２0s,收集ＤNA。

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（四）用DNA标记和检测试剂盒对IL-2探针进行地高辛标记地高辛是一种仅存在于洋地黄类物质花叶中的类固醇半抗原,又称异羟基洋地黄毒甙配基,地高辛精可以通过一个１1个碳原子的连接臂与尿嘧啶核苷酸嘧啶环上的第5组碳原子相连接形成地高辛精标记的尿嘧啶核苷酸,BoeｈringｅｒMannhｅim公司出售的地高辛精标记核苷酸有diｇ—ＵＴP，dig-dUTP，和dig-ddUＴP，它们分别适用于RNＡ探针，DNA探针和寡核苷酸探针的标记。

地高辛精标记核苷酸主要通过酶反应标记核酸探针，用标记探针做原位杂交，杂交体用特异性抗地高辛精抗体通过免疫组化技术检测。

在适宜的标记反应条件下，一般每２0~25个核苷酸中带有一个标记的核苷酸。

这一标记密度最利于半抗原与碱性磷酸酶标记的抗地高辛精之间的反应。

因为一个标记抗体大约复盖20个核苷酸。

ＢｏｅhringｅｒMａnnhｅim公司生产的地高辛精DNA标记试剂盒和地高辛检测试剂盒在分子杂交中的应用愈来愈广泛。

现介绍地高辛标记ｃDNＡ探针随机引物延伸法。

...感谢聆听...

1．、将DNA（１μg~3μg）加热９5℃（或1０0℃）１0min,随即在冰/NaCｌ中骤冷。

DＮA充分变性对探针标记十分重要.５μｌ对照ＤNＡ作为对照.

2、将离心管置于冰上,按顺序加入下列试剂:

①1μg～3μｇ新鲜变性DＮＡ;②2μl六聚核苷混合物（试剂５）；③2μl　dNＴP混合物（试剂6），加入蒸馏水使总体积达到19μｌ，再加入1μlKlenｏw聚合酶。

３、离心片刻后，将离心管置37℃恒温箱内孵育６0ｍｉｎ.延长孵育时间可长达20ｈ,可使标记量增加。

４、加入2μl０。

2mol／LEDTA（pＨ８。

0）终止酶反应。

5、加入2．5μl4mol/ＬLiCl和75μｌ　预冷（—20℃）的乙醇，混匀置—70℃3０ｍin或-２０℃2h，使标记探针沉淀。

6、离心（１６500ｒ／mｉｎ），弃上清液,用5０μl７０％冷乙醇轻洗沉淀物.

7、将沉淀物置于真空干燥仪内干燥后,溶解于50μl　TE缓冲液,－20℃冰箱保存.

（五）培养细胞ＲNＡ的提取（采用Tｒiｚｏl试剂盒提取ＲNA）

１、收集培养细胞，用RPMI—１６４0培养液离心洗涤３次,第二次离心洗涤时用RＰMI-１640培养液调整细胞数至5×106~１×10７细胞。

２、最后一次洗涤时吸1ｍl细胞悬液至１.5mlEP管中,在台式离心机离心,弃上清,加入1mｌＴRIＺOL试剂,用移液器轻轻吹打细胞数次，充分混匀,室温（15～３0℃）静置5min后，加入０．2ml氯仿,快速摇动15s,室温静置２～3ｍｉn。

3、于2～8℃离心1460０r/ｍin×1５min，上层无色水相（RNA溶于此层中）约占整个细胞匀浆液的60％.

４、小心吸取其中４00μｌ移至另一Epｐｅndorf管中，加入０。

5ml异丙醇，轻柔混匀,室温静置５～1０miｎ后。

５、于２～8℃离心1４６00ｒ/ｍin×１0mｉn，在管壁下底处可见一乳白色小沉淀块，即为RNA。

弃上清。

6．用冰冷的75%乙醇1ml洗RＮA沉淀（不用吹打沉淀）,然后于２~８℃，1１5０0r/min离心5ｍin，去除上层乙醇后于无菌环境（或真空）风干RNA沉淀,但不要使沉淀过于干燥，以免影响RNA的溶解，用20μlDＥPＣ处理的双蒸水溶解RNA沉淀。

置—80℃冰箱备用....感谢聆听...

（六）RＮA的斑点杂交

1、RNA变性:

2０μlＲNA溶液（２μgRNA）

4μl　２0×ＳSC

14μｌ37%甲醛（foｒmaldehyde）

４0μl1０0％甲酰胺

----—－-—－—－--－－----—--—--－———--—--—－

6０℃温育３０ｍiｎ,水浴冷却样品

在上述RNA液体中每1００μl液中加2１0μl２0×SSC（共31０μｌ），每孔加150μl。

２、纤维素膜处理过程：

硝酸纤维素膜（0。

4５μｍ）水中浸泡5min,再用２0×ＳＳC室温浸泡１ｈ。

3、滤器的处理及点样：

用0。

1N　NaOH浸泡（洗）多孔过滤加样器,再用灭菌水彻底冲液。

将纤维素膜压在多孔加样器的上层板的上面，再压在下层板上，赶去气泡,然后两部分夹紧,点样前，先用２0×SＳC（200μl）洗一遍每个孔，真空抽吸干净后,再分别点样。

如有未点样孔须用150μl的20×SSC封住其孔，然后用真空泵抽吸干净，再用20×ＳSC清洗一次，待流体滤过纤维膜后,继续抽吸5ｍin以干燥滤膜....感谢聆听...

4、取出膜,80℃烤２～3ｈ,膜保存于-20℃

配2０×SSC标准柠檬酸盐pＨ７．0

NａＣl175。

3g

Ｎa。

Ciｔrat88.２g（柠檬酸钠）

H２O至１00０ml

用１０ＮNaＯHoｒ10NHＣl调pH至7。

0,高压消毒

1NNaOH约０.５mｌ

5、杂交

（1）预杂交

1）预杂交液：

5×SSC,　0．７５%（W／Ｖ）封闭剂,０.1%（W/V）Ｎ-lａuroylsａｒcｏdｉnｅ,0。

０2%（W/Ｖ）SＤＳ

2）先将预杂交液热至　60℃。

3）将带有目的ＲNA的硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜的塑料袋,加入预杂交液,按每10０cm2滤膜加２０ｍl.

4）尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，将其置60℃水浴过夜，其间不断翻动塑料袋。

（2）杂交

１）杂交液（DIＧＥaｓy　Hyb（2０mｌ／1０0ｃｍ2）预温轻振荡30ｍin

2）将标记探针DＮA（5～25ng/ml）煮沸变性5min，迅速置冰水中冷却,

３）加入到预温的DＩGＥasyＨｙｂ（２．5ml/1０0cm2）中混合,避免形成汽泡

4）然后每张膜上注入预杂交液和滴加探针/DIGEａｓyHｙb

5）振荡孵育至少6ｈ，在微量DＮA时,建议16ｈ,使其杂交。

6）2×SSC,０.1%SＤS清洗2次,每次5ｍin,室温。

7）68℃振荡条件下,0。

１×ＳSＣ,0.1％SＤＳ清洗２次，每次15min。

（七）免疫测定

1、杂交后彻底清洗,将膜置入清洗缓冲液中1～５ｍin.

2.、１0０ml封闭缓冲液（1×）中封闭30ｍin。

3、抗地高辛—AP复合物（7５mU/ｍl）用封闭缓冲液（１×）1∶１0000稀释，

4、稀释的抗体溶液20ml与膜孵育3０miｎ。

5、100ml清洗缓冲液中２次，每次１5mｉｎ。

6、20ｍｌ测定缓冲液中平衡2~5min。

7、将膜置入新鲜制备的20ｍl显色液中孵育5min（暗处，即避光），显色过程中避免振动。

8、数分钟显色沉淀开始形成，１6h后反应完全,可短期在亮处观察显色情况

９、如果可见期望的斑点，加ＴＥ缓冲液50mｌ作用5ｍin终止显色（缓冲液4）.

（八）图象分析结果用MPＩＡS－5０0多煤体彩色图文分析系统，以0。

７85μm图查点长，在1.7１5×1０5μm2测量窗下测得各斑点的积分光密度值，以标准参数作图查得各样本的数值或将各组积分光密度值进行比较。

（九）注意事项

核酸探针的标记及杂交是一个很复杂的过程,　步骤多耗时长，影响因素多。

要想获得理想结果,　每一步都应严格操作。

１、严格操作标记和杂交的各种溶液应高压灭菌；含SDＳ,Ｔｗeen2０的溶液应经滤膜除菌后加入其它溶液；使用灭菌吸头、干净平皿,每次用前必须严格清洗。

操作膜时戴无尘手套;只用无齿镊操作膜的边缘。

原位杂交的每步反应均应加盖硅化的盖玻片

2、标记反应注意事项

（1）随机引物标记前必