PBOO对豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞形态结构的影响.docx

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PBOO对豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞形态结构的影响

PBOO对豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞形态结构的影响

【摘要】目的探讨豚鼠膀胱流出道梗阻对膀胱卡哈尔间质细胞形态结构的影响。

方法建立雌性豚鼠PBOO模型，并根据尿动力学检测结果将模型分为PBOO后逼尿肌不稳定组和PBOO后逼尿肌稳定组，以假手术组作为对照，饲养4周后取膀胱组织，制成全层组织铺片和冰冻组织切片，ckit免疫荧光染色分别观察各组膀胱肌层和黏膜下ICC的形态和分布情况。

结果PBOO4周后，DO组豚鼠膀胱出现排尿频率、排尿压力的增加，并且观察到明显的储尿期膀胱不稳定收缩。

对照组、DS组和DO组豚鼠膀胱均观察到ckit染色阳性且呈典型长梭形有突起的ICC，主要分布于平滑肌肌束间和黏膜下层；在DO组豚鼠的膀胱中ckit染色阳性的ICC分支突起增加且互相连接呈网络状，而在对照组和DS组中ICC呈散在分布，细胞之间联系较松散。

结论在PBOO所致DO豚鼠膀胱中ICC发生了形态和结构的变化，相互之间连接呈网络状，ICC的形态和结构的变化可能是逼尿肌不稳定的重要发病基础。

【关键词】卡哈尔间质细胞；逼尿肌不稳定；膀胱流出道梗阻；膀胱

　　Abstract：

ObjectiveToinvestigatethealteredmorphologycharactersofinterstitialcellsofCajalcells（ICC）inguineapigbladderafterpartialbladderoutletobstruction（PBOO）.MethodsPartialbladderoutletobstruction（PBOO）animalmodelswereproducedinfemaleguineapigsandwerevalidatedwithurodynamicexamination.AnimalswithunstablebladderpressureafterPBOOweresetasDOgroup.AnimalswithstablebladderpressureafterPBOOweresetasdetrusorstable（DS）groupandcontrolgroupwascomposedbyshamoperatedanimals.ImmunohistochemistrystudiesforckitasaspecificmarkforICCwereperformedonguineapigbladdersineachgroup.ResultsFourweeksaftersurgery,animalsinDOgroupshowedanincreasedvoidingfrequency,highervoidingpressureandirregularnonvoidingcontractions（n=12,）.WefoundincreasingmutualconnectionandmultilayerconstructioninsuburotheliumandintermuscularlayersofDObutnotDSandcontrolbladders.ConclusionThosefindingsdemonstratedthemorphologicalandstructuredifferencesofICCinguineapigbladderafterPBOO,whichsuggestICCbeinvolvedintheetiopathogenesisofDO.

　　Keywords：

cajalinterstitialcells;detrusoroveractivity;partialbladderoutletobstruction;bladder

　　膀胱逼尿肌的兴奋和收缩可受神经、体液等多种因素的调控和影响。

目前的研究表明，膀胱平滑肌的兴奋调控可能与一种特殊的间质细胞，卡哈尔间质细胞有关[1]。

ICC首先在胃肠道组织中发现，其细胞膜上带有特异性的ckit受体酪氨酸激酶的表面标记。

ICC对胃肠道基本电节律的形成、神经传导的调控、信号整合等多种生理功能起到了重要的作用。

目前，在胃肠道组织以外的多种平滑肌组织陆续发现了ICC的存在[3～4]，但是胃肠道外ICC的功能学研究尚处于起步阶段。

　　逼尿肌不稳定（DetrusorOveractivity，DO）是常见的膀胱功能障碍，临床上常表现为一种以尿急症状为特征的征候群，常伴有尿频和夜尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁；尿动力学上可表现为膀胱储尿期的膀胱不稳定收缩。

根据2002年国际尿控协会的定义，DO在尿动力学的描述中为充盈期出现无意识的逼尿肌自发或经诱发的收缩。

　　DO常伴发于膀胱流出道梗阻的患者。

然而相当一部分患者在机械梗阻病因解除后排尿功能障碍并未得到有效缓解，提示逼尿肌不稳定的发病机制还有待进一步研究。

既往的很多研究中关于神经调控异常和逼尿肌自身的结构变化等假说也不能满意的解释DO的发病原因，而ICC在膀胱中的发现和初步研究表明，膀胱ICC在调节膀胱的局部收缩和逼尿肌自发性兴奋中可发挥重要的作用，因此，基于膀胱ICC的相关研究可能是对DO等膀胱功能障碍性疾病发病机制的重要补充。

　　本研究建立膀胱流出道部分梗阻致DO模型，通过免疫荧光标记的方法，比较ICC在PBOO膀胱中形态结构的差异，为进一步认识DO的发病机制打下一定基础。

　　1材料与方法

　　主要材料与试剂健康雌性豚鼠，体重320～460g，3～4月龄，购自第三军医大学动物实验中心。

激光共聚焦显微镜，RM6240多通道生理检测仪，微量输液泵，羊抗豚鼠ckit多克隆抗体，大鼠抗豚鼠平滑肌肌动蛋白（SMM）单克隆抗体，驴抗羊AF488荧光二抗、驴抗大鼠AF594荧光二抗，DAPI细胞核染料。

　　实验方法

　　豚鼠膀胱流出道部分梗阻模型建立参照Kubota等人的实验方法构建豚鼠DI模型。

简述1%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，将直径为1mm的硬膜外导管经尿道外口插入膀胱，以此作为尿道支撑。

取下腹部正中切口，长约～2cm，切开皮肤及皮下组织，剪开腹直肌前鞘腱膜，分离腹直肌，找到膀胱，仔细游离膀胱-尿道交界处，近端尿道稍作分离，于此处穿过2-0丝线，结扎近端尿道，结扎丝线的松紧标准以牵拉探子时周围组织可随之移动，而探子又可轻易拔除为度，然后拔除探子，逐层缝合关闭切口。

假手术组动物按照上述手术方法行开腹及近端尿道钝性分离，但不行结扎梗阻实验，作为对照。

术后每只豚鼠单笼喂养，保持动物笼清洁干燥。

所有实验动物术后适量使用抗生素：

庆大霉素mg/kg，腹腔注射，1次/d，共3d。

　　豚鼠膀胱尿动力学检测PBOO手术4周后行尿动力学检测。

25%乌拉坦溶液按1g/kg体重腹腔内注射麻醉。

豚鼠取仰卧位，四肢固定，乙醇消毒尿道外口及会阴部，将外直径为1mm的硬膜外导管经尿道外口插入膀胱（见尿液流出）；若为PBOO后模型豚鼠，可打开腹腔解除梗阻后再行插入。

轻压豚鼠腹部，排尽尿液，导管接5号针头，经三通管与尿动力检测仪及微量灌注泵相连。

设置测压参数：

压力模式，扫描速度10s/div，灵敏度cmH2O，时间常数直流，采集频率400Hz，滤波频率30Hz；标定零点。

用微量灌注泵以ml/min速率灌注，膀胱灌注液采用生理盐水，同步记录随容积增加膀胱压力波形、膀胱容量以及排尿间隔时间。

　　豚鼠膀胱组织铺片和冰冻切片免疫荧光染色在标本制作中使用组织冰冻切片和组织全层铺片两种方法，前者主要观察黏膜下ICC；而后者主要用于观察肌层的ICC。

组织铺片的制作方法为：

断颈处死动物，下腹部正中切口暴露膀胱，结扎双侧输尿管，将4％多聚甲醛自尿道注入膀胱内，维持充盈状态并固定10min。

将充盈的膀胱剪下置入4％多聚甲醛中继续固定6～8h后，沿腹侧面纵行剪开，在解剖显微镜下，小心剔除黏膜层。

将肌层组织制成含1～2层肌细胞厚度约100～200μm的组织铺片。

冰冻切片的制作方法为：

动物处死和标本采集同上，膀胱组织4％多聚甲醛固定6～8h，10%～30%蔗糖溶液梯度脱水过夜，-20℃下OCT冰冻包埋液包埋组织，冰冻切片机沿垂直于黏膜层方向行20μm冰冻切片，贴于多聚赖氨酸处理防脱载玻片表面。

切片和铺片标本的荧光染色方法相同，简述1%BSA室温孵育1h后加入羊抗豚鼠ckit和大鼠抗豚鼠SMM一抗4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次10min，加入驴抗羊AF488和驴抗大鼠AF594荧光二抗室温孵育1h，DAPI复染细胞核10min，PBS漂洗2次，每次10min。

激光共聚焦显微镜观察。

　　统计学方法数据用x±s表示，软件进行t检验。

　　2结果

　　PBOO模型制作和尿动力学检测PBOO模型组动物18只；对照组动物5只。

模型组意外死亡4只，排除实验，对照组动物全部存活。

对照组膀胱充盈性测压曲线较平滑，排尿反射存在，充盈过程中可观察到少量自发性收缩，幅度微小，如图1A所示。

PBOO后9只豚鼠出现膀胱测压曲线不平滑，膀胱容量及压力增加，排尿反射频繁，充盈过程中自发性收缩波幅增大，定义为DO组。

另5只豚鼠梗阻后压力稳定膀胱测压曲线较平滑，膀胱容量和排尿压力均显着大于正常对照组，膀胱充盈过程中未见自发性收缩波，定义为逼尿肌稳定（DetrusorStable，DS）组。

各组的尿动力学检测结果见表1。

　　膀胱组织免疫荧光染色组织铺片荧光染色可见豚鼠膀胱组织平滑肌束间和肌束内有形态典型的ckit阳性的ICC细胞（封4图3A，箭头所示），大部分细胞呈纺锤形或长梭形有突起，散在分布于平滑肌肌束之间，少量存在于平滑肌肌束内，缺乏相互的连接。

少量ckit阳性细胞为圆形或类圆形无突起和侧枝，根据文献报道，该类细胞为肥大细胞。

DS组豚鼠膀胱组织ckit染色阳性的ICC细胞分布和形态与对照组类似。

而在DO组我们观察到ckit阳性的ICC的形态和组织结构发生了变化，逼尿肌束之间的ICC排列较为紊乱，细胞突起数量较对照组和DS组明显增多且相互观察到排尿连接呈网状，。

在切片标本中我们主要观察黏膜下层ICC，正常膀胱和DS膀胱中黏膜下ckit阳性的ICC紧贴黏膜层，相互之间首尾相接，呈1～2层排列，而DO膀胱中黏膜下ICC层次明显增多，ICC排列较为紊乱。

黏膜层由于上皮细胞对抗体的黏附作用，因此SMM和ckit均为阳性，染色呈金黄色，。

　　图1各组膀胱充盈测压曲线

　　A、B、C分别为对照组、DS组和DO组，箭头示

　　表1各组动物充盈性膀胱测压结果

　　与对照组比较,①；与DS组比较,②

　　3讨论

　　DO是常见的膀胱功能障碍性疾病。

以往基于神经控制理论，提出了许多DO发病机制的假说，如：

神经超敏学说、受体分布失衡学说等等[8～9]。

但是临床上针对DO的治疗难以取得令人满意的疗效。

很多学者都发现了膀胱逼尿肌在去神经状态下可以出现自发性的收缩，这种自发的逼尿肌活动在DO膀胱中具有高频率、低阈值的特点。

因此，膀胱功能调控除了神经因素之外的膀胱源性局部因素受到了越来越多的关注。

很多研究都表明，膀胱平滑肌的兴奋调控可能与一种特殊的间质细胞，ICC有关。

膀胱中存在ICC最初是在2002年由英国学者McCloskey发现[10]，在他的一系列研究中探讨了膀胱ICC的分布、形态学特征及其与神经的相互关系，2007年的第五届国际Cajal间质细胞论坛建议将