叶绿体色素的提取.docx
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叶绿体色素的提取
叶绿体色素的提取、分离、理化性质和含量测定
Ⅰ提取与分离
实验日期:
2011.10.22
实验者:
XXX
同组姓名:
XXX
一、实验目的:
1.学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2.了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。
二、实验原理:
叶绿体是进行光合作用的细胞器。
叶绿体中的叶绿素a,叶绿素b,胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。
这些色素都不溶于水而溶于有机溶剂,故可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。
植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法,其中柱层析适用于大量制备。
本实验采用薄层层析色谱法,其中固定相用硅胶预制板。
三、实验材料与试剂:
1.新鲜的菠菜叶片。
2.体积分数为95%的乙醇,碳酸钙粉末,展开剂。
3.研钵,漏斗,滤纸,三角瓶,剪刀,点样毛细管,层析缸,硅胶预制板。
四、实验步骤:
(一)色素提取液的制备
1.取新鲜叶片4~5片,洗净,擦干叶表面,去除中脉剪碎(越碎越好),放入研钵中。
2.向研钵中加入少量CaCO3,加2~3ml体积分数为95%的乙醇,研磨至糊状,再加10~15ml体积分数为95%的乙醇,上清液用漏斗过滤出,残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次,一同过滤于三角瓶中,即制成叶绿体色素提取液。
提取液应尽量避光保存。
因提取量较大,可用于其他相关实验(即用于后面的理化性质的验证)。
(二)叶绿体色素的分离
1.取硅胶预制板一个,用点样毛细管吸取上述提取液,平行于硅胶板的短边,距下边缘1cm处用毛细管划线,自然风干后划第二次,重复操作3~4次,确保划的滤液细线颜色足够深,使分离结果更加明显。
2.取已经加入适量展开剂的层析缸,把硅胶预制板带有色素的一端放入,使其下端浸入展开剂中,但注意液面不可超出滤液细线。
迅速改好层析缸盖减少展开剂的挥发对人体产生的不良影响。
注意观察展开剂的扩散过程,当各种色素得到较好分离,且展开剂前沿接近硅胶预制板上端边缘处时,取出硅胶预制板迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。
注意要迅速,否则展开剂前沿很快会挥发消失,且前沿和各个色素带的位置均会有微小变动。
3.测量出前沿和各个色素带距离原点的距离并记录。
五、实验结果与分析(以图辅助以文字展示):
.
自上而下分别为:
胡萝卜素,叶绿素a,叶绿素b,叶黄素。
各自到原点的距离:
展开剂前沿:
8.50cm
胡萝卜素:
8.10cm,Rf=0.95
叶绿素a:
6.70cm,Rf=0.79
叶绿素b:
6.30cm,Rf=0.74
叶黄素:
5.90cm,Rf=0.69
事实上实验中不止看到了这四种色素带,在它们下面还有一些分离出来的色素带,但是不在本实验的讨论范围中,故不予考虑。
Ⅱ理化性质
一、实验目的:
验证叶绿体素的理化性质。
二、实验原理:
1.叶绿素可与碱起皂化反应产生的盐能溶于水中,因此可用此法分离叶绿素和类胡萝卜素。
2.叶绿素吸收光子而转变成激发态,激发态的叶绿素分子很不稳定,当它变回基态时可发射出红光量子因而产生荧光。
3.叶绿素的化学性质很不稳定,易受强光的破坏,特别是当叶绿素与蛋白质分离后,而类胡萝卜素则较稳定。
4.叶绿素中的镁可以被H+取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜成为铜代叶绿素,铜代叶绿素很稳定,在光下不易被破坏,故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
三、实验材料与试剂:
1.新鲜菠菜叶片。
2.叶绿素提取与分离实验中剩余的叶绿素提取液。
3.小试管,试管架,水浴锅(60℃和90℃各一个),10ml移液管,洗耳球,三角瓶。
4.体积分数为95%的乙醇,笨,醋酸铜粉末,质量分数为5%的稀盐酸,醋酸-醋酸铜溶液,氢氧化钾-甲醇溶液。
四、实验步骤:
(一)光对叶绿素的破坏作用
取2支小试管,各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液,并用乙醇稀释一倍。
其中一支放在直射阳光下,另一只用锡纸包严,40min后对比观察颜色有何变化。
(二)皂化作用(绿色素与黄色素的分离)
1.取1支小试管加入3ml浓的叶绿素乙醇提取液,加入1ml氢氧化钾-甲醇溶液,充分摇匀。
2.片刻后,加入3ml苯,摇匀,再沿试管壁慢慢加入1ml左右蒸馏水,轻轻混匀(勿激烈摇荡),然后置于试管架上静置分层。
若溶液不分层,则用滴管吸取蒸馏水,沿管壁滴加,边滴加边摇动,直到溶液开始分层时静置。
(三)H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用
1.取2支试管,第一支加叶绿体色素提取液5ml,作为对照。
第二支试管加叶绿体色素提取液5ml后,再加入质量分数为5%的稀盐酸数滴,摇匀,观察溶液颜色变化情况。
当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末,60℃水浴加热,观察溶液颜色变化情况,并与对照试管相比较。
2.取新鲜菠菜叶片两小片(能塞进小试管即可),放入试管中,加醋酸-醋酸铜溶液,使之没过叶片,90℃水浴加热,随时观察叶片颜色的变化,直至颜色不再变化为止。
(四)荧光现象的观察实验前
取一支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液,在直射光下照射,比较溶液的透射光与反射光颜色有何不同。
五、实验结果与分析(以图辅助以文字展示):
(一)光对叶绿素的破坏作用
利用另外一支试管取未用锡箔纸包的叶绿素溶液进行对比如图,右边为光照后的叶绿素溶液
实验前(左边光照)
实验后(由于实验过程中包锡箔纸的试管不慎打翻导致现在这样)
(二)皂化作用(绿色素与黄色素的分离)
有明显的分层现象,上层显黄色,下层显绿色。
(三)H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用
绿色→ → → → 黄色 → → → →绿色
(四)荧光现象的观察
反射光明显是红色的
明显透射光是绿色的