单克隆抗体制备实验过程.docx
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单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程
一、免疫动物
免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
【材料和试剂】
（1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
（2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。
拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。
无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。
将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。
然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。
（3）饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。
用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。
右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。
1000r/min离心5-10分钟，弃上清。
先用5mlHAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。
（4）主要试剂的配制
①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（DulbercoModifiedEaglesMedium）两种基础培养基，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。
不完全RPMI-1640培养基：
RPMI-1640培养基原液
96ml
100×L.G.溶液
1ml
双抗溶液
1ml
7.5%NaHCO3溶液
1-2ml
HEPES溶液
1ml
不完全DMEM培养基：
DMEM
13.37g
超纯水或四蒸水
980ml
NaHCO3
3.7g
双抗溶液
10ml
100×L.G.溶液
10ml
用1NHCl调试PH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。
完全RPMI-1640或DMEM培养基：
不完全RPMI-1640或DMEM培养基
80ml
小牛血清
15-20ml
HT或HAT培养基：
HT培养基
HAT培养基
完全RPMI-1640或DMEM培养基
99ml
98ml
HT贮存液
1ml
1ml
A贮存液
1ml
②氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L）
称取1.76mg氨基喋呤（AminopterinMW440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。
过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。
③次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液（100×，H：
10-2mol/L，T：
1.6×10-3mol/L）
称取136.1mg次黄嘌呤（Hypoxanthine，MW136.1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，MW242.2），加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。
用前可置37℃加温助溶。
④L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）
称取2.92gL-谷氨酰胺（L-glutamine，MW146.15），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。
⑤青、链霉素（双抗）溶液（100×）
取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。
⑥7.5%NaHCO3溶液
称取分析纯NaHCO37.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），盖紧瓶塞，4℃保存。
⑦HEPES溶液（1mol/L）
称取23.83gHEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonicacid，N-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸，MW238.3）溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。
⑧8-氮鸟嘌呤贮存液（100×）
称取200mg8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，MW152.1），加入4mol/LNaOH1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。
使用时按1%浓度加入到培养液中（即终浓度为20ug/ml）。
⑨50%PEG
称取PEG1000或400020-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用。
临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5%NaHCO3调PH至8.0，或购买Sigma或Gibco公司现成产品。
（5）24孔及96孔培养板等细胞培养所用材料和试剂。
【操作步骤】
（1）将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1：
5～1：
10比例混合，加入20～50mlRPMI-1640液。
（2）1000r/min×6～10min离心弃上清，将上清尽量吸净。
（3）用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散，将离心管置37℃水浴中。
（4）吸取1ml37℃预温的50％PEG缓慢滴入离心管内，45秒左右加完，边加边轻轻搅拌，37℃静置1～5min。
（5）在5min内滴加不完全完全培养液（37℃预温）20ml，第一分钟内滴加1ml，第2分钟2ml，第3分钟5ml，第4和第5分钟各6ml，同时应边加边轻轻地转动离心管，应沿管壁滴加，不应直接滴加在沉淀细胞上，以防将刚融合的细胞冲开。
然后加1640液至50ml使PEG作用终止。
（6）800r/min×5～10min离心，弃上清。
（7）将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的HAT培养液中，接种24孔板（每孔1.0-1.5ml）或96孔培养板（每孔0.10-0.15ml）。
（8）接种完毕后，将培养板放入37℃5％CO2温箱中培养。
PS:
1、冻存的骨髓瘤细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，培养目标是使处于对数生长的时间尽可能长。
2、饲养层细胞应在使的前一天制备好，这样才能分泌足够的细胞因子。
三、选择性培养
原理：
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。
未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
（1）接种24孔板或96孔板5天后，用HAT培养基换出1/2培养基。
（2）7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。
PS:
1、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定，一般制备单抗的目的决定了筛选克隆所用的方法。
由于融合后，细胞上清份数多，但每份体积有限，因此ELISA是最适合用于初步筛选的方法。
经过ELISA筛选出的阳性克隆即可进行克隆化，因为如果不进行克隆化，当阳性孔有非抗体分泌型的杂交瘤时，非抗体分泌型的杂交瘤由于生长速度更快，将会占主导生长，最终很难分离出目标杂交瘤以至丢失。
另外杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。
通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化，有时还需进行多次。
克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。
（1）包被将抗原以pH9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每块酶标板以5-20ug抗原为宜（如果抗原为多肽或小分子物质，则需要加大包被量）。
每孔的包被体积为50-100ul。
37℃包被2h或4℃包被过夜。
（2）封闭倒掉抗原，拍干酶标板孔内液体，以0.5-1%BSA（用PBST溶解）或5%脱脂牛奶（PBST溶解）或1%明胶（PBST溶解）于37℃封闭2h或4℃封闭过夜，也可以使用10%小牛血清或其它无关物种血清封闭。
封闭完后可立即使用，也可以洗涤一次置于4℃密封保存以备后面使用。
（3）一抗封闭完后，弃去孔内液体，拍干，加入待检测细胞上清，每孔100ul为宜。
在每块板子上做好记号。
37℃孵育1h。
（4）二抗孵育完一抗后，弃去孔内液体，拍干，以PBST洗涤3次，每次5min。
根据二抗说明稀释好二抗，每孔加入100ul.37℃孵育1h。
（5）显色孵育完二抗后，弃去孔内液体，拍干，加入显色剂。
待颜色最深时用终止液终止反应。
用酶标仪读出各孔OD值，选择出阳性孔。
（1）有限稀释法
从有限稀释的原理以及影响因素可以知道，其克隆化结果应该是一个修正的泊松分布：
式中λ在有限稀释里的意义是稀释时设计的每孔细胞的平均数,k则代表可能出现的细胞个数。
材料：
a、96孔细胞培养板等；b、HT培养基；c、活力强的杂交瘤细胞；d、小鼠腹腔细胞。
方法：
a、制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）。
b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3中不同的稀释度。
c、按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。
d、每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。
e、37℃、7.5%CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。
f、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。
g、本法中（b）、（c）、（d）也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。
（2）软琼脂法
材料：
a、HT培养基（双倍浓度）。
b、用0.15mol/LNaCl配制的2.0%琼脂糖：
称取2.0g细胞培养用琼脂糖，悬浮于100ml0.15mol/LNaCl，121℃高压灭菌15分钟，分装10ml小瓶，冷却后4℃保存。
c、小鼠腹腔细胞。
d、灭菌平皿。
e、45℃水浴。
f、活力很好的杂交瘤细胞。
方法：
a、在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。
b、临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1%琼脂糖培养液，45℃水浴中温育。
c、吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10分钟。
d、取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层。
e、37℃、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。
f、吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。
PS：
1、细胞融合后，一旦鉴定可以产生目标抗体，就应立即进行克隆化，确保能分离出单个细胞重新形成克隆。
2、经多次尝试，确定修正公式中的a值，为以后的实验提供一个比较稳定的经验λ值。
3、应在克隆前1天制备好饲养细胞层。
五、单克隆抗体的大量制备
单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生腹水法和体外培养法。
1.用20G或22G的注射针，小鼠腹膜内注射降植烷，每只鼠0.5~1ml，1周后接种细胞。
2.在175cm2培养瓶中加完全DMEM-10/HEPES/丙酮酸钠培养液，进行杂交瘤细胞的培养，使细胞生长至对数期。
3.将培养液转入50ml锥形离心管中，室温下500g离心5min。
4.细胞重悬于50ml无菌的PBS或HBSS（不含FBS）中洗涤。
然后室温下500g离心5min，弃上清。
重复2次，然后细胞重悬于5ml的PBS或HBSS中。
5.计数细胞，通过台盼蓝染色法确定细胞活力。
6.用不含FBS的HBSS或PBS调整细胞浓度至2.5×102细胞/ml。
7.用一个10ml的无菌的带22G针头的注射器，对裸鼠进行腹膜内注射2ml细胞，等待腹水形成（1~2周）。
8.收获腹水。
（1）一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮肤绷紧。
（2）另一只手将一只18G的计头插入小鼠腹腔1~2cm深。
（3）进针部位为左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官，以及腹中线处的主要大血管。
（4）令腹水滴入一只无菌的15ml聚丙烯锥形离心管中。
9.于室温下，1500g离心腹水10min，收集上清，弃沉淀，将腹水存放于4℃，直到收集腹水的工作完成（在1周内）。
10.再次收获腹水前，让小鼠再次积累腹水（2~3天），具体操作同步骤8，腹水的加工处理操作同步骤9。
重复这个过程直到再没有腹水产生可供收集，或者小鼠健康状况不佳。
11.把在几天内收集到的腹水汇集到一起，于56℃水浴45min进行热处理，如果凝块形成，可用牙签挑出除之，然后再离心。
12.采用适当的方法检测腹水中的MAb的效价。
13.按大于1：
10的比例稀释MAb，并进行滤过除菌，滤膜孔径为0.45μm，分装并冻存于-70℃，避免反复冻融，可冻存数年之久。
PS：
1、腹水含有大量的油脂、巨噬细胞、杂交瘤细胞、腹腔内的上皮细胞、血液中的细胞成份等杂质，应先离心除去这些成份。
2、油脂的密度比较小，一般都漂浮在腹水表面，用枪吸出丢掉即可。
六、辛酸-硫酸铵两步沉淀法纯化单抗
1、原理
在酸性条件下（pH4.5），非IgG的蛋白成份（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。
2、方法
（1）将腹水用0.06M醋酸钠（pH4.0）按1：
3稀释，用1mol/LNaOH调至血清稀释液为pH4.5。
（2）室温下边搅拌（磁力搅拌器或电功搅拌器），边缓慢滴加辛酸（一般按每毫升稀释前的腹水加入40ul正辛酸），滴加完后继续搅拌30min。
（3）4℃静置2h。
（4）4℃10000g离心20min，可见辛酸因温度低而从系统中结晶析出漂浮在腹水上层，用多层纱布过滤，弃去此结晶以及底部沉淀，收集上清夜。
（5）向上清中加入1/10体积的10×PBS（0.1M，pH7.4）。
（6）4℃条件下，向其中加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为45％饱和度，静置1h以上。
（3）10000g离心10-20min；弃上清，将沉淀溶于适量1×PBS中，再将其装入透析袋用10mM的tris或PBS透析（透析液应为抗体体积的100倍以上，最好搅拌），4℃过夜。
（4）收集透析好的抗体，直接现用或加入保护剂和防腐剂长期保存（-20℃保存或冻干保存）。
用这种方法纯化出来的抗体纯度可达80-90%左右，损失较少，对抗体的活性损失也较少，试剂成本低，但是操作比较费时。
3、蛋白含量测定
紫外分光光度法测样品在波长260nm，280nm处的I及收光度（A260,A280），蛋白含量按以下公式计算
蛋白量（g/L）=（1.45×A280-0.74×A260）×稀释倍数
注：
1、单抗制备（小鼠）中的杂交瘤细胞是半贴壁型的细胞。
2、在使用之前需要加入15%-20%胎牛血清，胎牛血清可以为细胞提供更多的生长因子和激素等活性物质。
3、HAT选择培养基中，H（次黄嘌呤）的浓度为1×10-4M，A（氨基蝶呤）为4×10-7M，T（胸腺嘧啶）为1.6×10-5M，在HT培养基中，只需要不加氨基蝶呤，其它都同HAT。
进行选择性杀死非目标细胞。
4、为防止细胞污染，通常用的抗生素有青霉素（100U/ml）和链霉素（100ug/ml）、四环素（50ug/ml）、庆大霉素（50ug/ml），其中青霉素和链霉素联合使用较为常用，俗称“双抗”。
5、取少量分装的培养基加入至液体LB培养基里37℃培养过夜进行无菌测试（其它4℃保存），确认培养基无菌后才能使用。
6、LB培养基的配制：
胰蛋白胨（tryptone）10g酵母提取物（yeastextract）5g氯化钠（NaCl）10g固体培养基另加琼脂粉15-20g加双蒸水至1000mL,用5mol/LNaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min。
7、融合所用的瘤细胞是选择出来的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase,HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（thymidinekinase,TK）缺陷细胞株，从而能有效地阻断瘤细胞DNA合成的外源性途径。
8、在瘤细胞利用磷酸核糖、氨基酸、CO2和NH3等化合物合成核苷酸过程中，叶酸是重要的辅酶，而氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞DNA合成的内源性途径。
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