年产30吨白藜芦醇的车间设计论文.docx
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年产30吨白藜芦醇的车间设计论文
目录
摘要
关键字
1前言
1.1DNJ简介
1.2HPLC法简介
1.3国内外研究动态
1.4DNJ的作用和研究意义
2材料与仪器
2.1材料
2.2设备和仪器
2.3试剂
3方法与步骤
3.1桑叶样品的制备
3.2DNJ标准液的配制
3.3DNJ的衍生化
3.4高效液相色谱测定
3.5精密度实验
3.6稳定性实验
3.7重现性实验
3.8回收率实验
4结果
4.1标样高效液相图谱
4.2样品高效液相色谱
4.3标准曲线的制备
4.4精密度实验结果
4.5稳定性实验结果
4.6重现性实验结果
4.7回收率实验结果
5讨论
6结论
参考文献
致谢
应用HPLC测定桑叶中DNJ的含量
学生：
章珍亭
指导老师：
唐忠海讲师
（湖南农业大学东方科技学院长沙410128）
摘要：
本实验以桑叶为材料，以0.05mol/LHCl为溶剂提取桑叶中的1-脱氧野尻霉素，并用芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl）为衍化剂，在PH8.5的硼酸盐缓冲液中进行衍生化反应，生成具有紫外吸收的DNJ-FMOC的络合物，再用高效液相色谱-紫外检测法对其分离测定。
通过精密度，稳定性，重复性试验，回收率来确定桑叶中DNJ的含量。
结果表明,反应产物的色谱图分离效果良好DNJ-FMOC的峰面积与DNJ浓度呈高度正相关关系,加样回收率平均为101.4%。
精密度试验、稳定性试验、重现性试验、回收率试验表明,该方法稳定可靠,可以作为测定桑叶中DNJ含量的有效方法。
关键词：
高效液相色谱；1-脱氧野尻霉素；精密度；稳定性；重复性；回收率
DeterminationofDNJinMorusalbaL.leavesbyHPLC
Student:
ZhangZhenting
Tutor:
TangZhonghai
（OrientScienceandTechnologyCollegeofHnnanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China）
Abstract:
Inthisexperiment,1-deoxynojirimycin（DNJ）inthemulberryleafpowderwasextractedwith0.05mol/LHCl,thenitwasderivedbyfluorenylmethyl（FMOC）inpH8.5boratebuffersolution.DNJ-FMOCcameintobeingcomplexcompound,whichcanbedetectedbyultraviolet,WeseparatedanddetecteditbyUV-HPLC.Theresultindicatedthattheproductwasseparatedentirely.TherearethemostpositiverelevancebetweenthepeakareaofDNJ-FMOCandtheconcentrationofDNJ.Theaveragerecoveryratioofaddingsampleis101.4%.Theprecisionexperiment,stabilityexperiment,repeatabilityexperimentandrecoveryrateexperimentshowedthatthemethodiscredible,soitcanbeusedasanefficientmethodtodetectDNJcontentinthemulberry.
Keywords:
HighPerformanceLiquidChromatography;1-Deoxynojirimycin；precision;
Stability;repeatability;recoveryrate
1前言:
1.1DNJ简介
DNJ（1-脱氧野尻霉素）是一种哌啶生物碱，其化学名称是3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶[2]。
是1-Deoxynojirimycin的缩写[3]。
分子式是C6H13NO4，分子量为163[4]。
现代药理研究表明，桑叶中的多羟基生物碱类成分具有显著的降血糖作用，其中1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirmycin,DNJ）是最有潜力的一种糖苷酶抑制剂[5]，通过抑制酶分解淀粉和糖，并阻止葡萄糖的吸收，从而降低血糖水平[6,7]。
野尻霉素（nojirimycin）首先由Inoue等作为抗生素从链霉菌中得到的，DNJ是由野尻霉素氢化得到的。
DNJ的来源有两大类：
植物来源和微生物来源。
植物来源包括桑叶及桑根皮，野砣草（Commelinacommunis）,风信子（Hyacinthusorientalis），沙参属植物（Adenophoratriphyllavar.japonia），爵床科植物（Jacobiniasuberecta）。
微生物来源包括浅紫灰链霉菌GC-148（StreptomycesLavendulaeGC-148）和芽孢杆菌（Bacillus）。
目前对DNJ的检测方法主要有高效液相色谱法（荧光检测，蒸发光散射检测）和气相色谱法。
1.2HPLC法简介
高效液相色谱法的灵敏度高，但高效液相色谱法灵敏度不及气相色谱法且同时存在柱外效应。
而用气相色谱法测DNJ的技术还不十分成熟。
在提取分离的技术上，前人进行了很多的探索，最终却都只是初步纯化，未得到真正的DNJ的纯品，在定性定量的检测方面，从普通分光光度计发展到利用HPLC，将柱前衍生和荧光检测相结合，精度得到了很大的提高。
高效液相色谱法是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。
高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点：
高压：
流动相为液体，流经色谱柱时受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。
高效：
分离能效高。
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
高灵敏度：
紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。
应用范围广：
百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是在对沸点高、大分子、强极性、热稳定性差的化合物的分离分析时，显示出优势。
分析速度快、载液流速快：
较经典液体色谱法速度快很多，通常分析一个样品在15至30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、容易回收利用等优点。
但也存在缺点，与气相色谱法相比各有所长，相互补充，高效液相色谱法的缺点是有“柱外效应”。
在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著的导致色谱柱的加宽，柱效应降低。
高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。
1.3国内外研究动态
目前国外尤其是日本和韩国对桑叶的有效成分研究较多，发现其中有效成分DNJ具有降血糖等作用。
我国仅有少数一些学者对桑叶生物碱DNJ进行过研究，对DNJ的提取检测工艺研究较少。
目前对DNJ的检测方法主要有高效液相色谱法（荧光检测，蒸发光散射检测）和气相色谱。
不同的研究者应用不同的检测设备建立了相应的检测方法[8]。
对于DNJ的提取检测方法，杨海霞采用蒸馏水提取法。
提取了桑叶中的DNJ，然后利用阳离子交换柱层析对DNJ进行了初步纯化，最后用分光光度法测定桑叶中DNJ的含量[9]。
这是DNJ提取分离中最初的方法，只对DNJ进行了初步分离，并且用分光光度法测量DNJ含量，精确度不高。
姜永涛等在2005年采用去离子水煎煮法，提取桑叶中的DNJ，然后再用732（H+型）离子交换树脂对DNJ进行初步纯化，最后采用高效液相色谱法，使用氨基分析柱和蒸发光散射检测器（ELSD）对桑叶及蚕沙中DNJ进行了检测[10]。
欧阳臻等在2005年采用0.05mol/L盐酸提取桑叶干粉末中的DNJ，在pH8.5的硼酸盐缓冲液条件下，用RMOC-CI与DNJ反应生成荧光产物，然后用高效液相色谱-荧光检测器测定DNJ的含量[11]。
刘卫旗，朱祥瑞在2006年同样采用蒸馏水提取桑叶、桑枝木质部中的DNJ，之后采用732（H+型）离子交换树脂对DNJ进行初步纯化，但最后采用的是HPLC-PDA法对DNJ进行分析测定[12]。
此法比较上述分光光度法较精确。
李宇亮等在2006年研究了从桑叶中提取分离DNJ，探讨了提取剂，提取方法，料液比，提取次数，时间等因素对提取率的影响。
实验得到了提取的最佳条件：
以65％的乙醇为提取剂，按料液比1：
8和1：
4，超声强化细胞破碎20分钟（功率1800W），732H阳离子树脂分离，0.25mol/L氨水洗脱（速度1～2mol/min）[13]。
李宏等在2006年为了快速测定桑叶中的DNJ的含量，利用化学合成法将DNJ转化为沸点较低的脂类物质，并首先建立了用气相色谱法快速检测DNJ的新方法[14]。
张作法等在2006年测定桑叶中DNJ含量时，采用的是盐酸，超声波提取，RMOC-CI标记，用配有荧光检测器的反相高效液相色谱法检测DNJ的含量[15]。
马静等提出可采用煎煮法，浸渍法，渗漉法，超声法和回流法等方法进行DNJ的提取，同时提出可采用大孔树脂吸附法，高效逆流色谱技术，超声波萃取技术，超临界萃取法等方法来进一步的分离纯化[16]。
这些均有很好的借鉴作用。
经过前人的不断探索，不论是对DNJ的提取分离还是对DNJ的定性定量检测方面都取得了很大的进步。
1.4DNJ的作用和研究意义
目前，全球的糖尿病患者已达1.5亿，并且数目还在增长。
现在已经仅次于心血管病，癌症的第三致死疾病[17]，因此预防和治疗糖尿病，药物研究和开发引起了众多专家及医疗结构的高度重视。
而DNJ的作用主要有：
DNJ对α-葡萄糖苷酶的抑制作用：
DNJ是所有哺乳动物α-葡萄糖苷酶的有效抑制剂，它能通过降低碳水化合物的消化和葡萄糖的吸收来降低食后高血糖。
由于这一特性，DNJ可治疗糖尿病的发作，肥胖症和相关的机能紊乱。
Kimura等[18]在2007年通过实验表明DNJ浓缩粉比直接服用桑叶粉抑制食后高血糖作用好得多。
因此可开发DNJ浓缩粉，作为食品补充剂，预防糖尿病。
DNJ对病毒的抑制作用：
有报道发现DNJ对病毒的活性有抑制作用，有显著的抗逆转酶病毒活性[19,20]，具有抗人艾滋病病毒HIV作用。
体外实验表明，艾滋病的病原体HIV是借助外膜糖蛋白（gp120）附着于T辅助细胞的CD4细胞受体上，通过细胞融合形成合胞体启动感染环的。
由于桑白皮的有效成分1-脱氧野尻霉素是α-葡萄糖苷酶的抑制剂，可干扰gp120一侧链多聚糖结构的合成，从而阻断gp120和CD4之间的结合，减少或阻止合体细胞形成，减弱HIV的感染力。
最近报道有两种新的抗HIV药为DNJ的衍生物：
N-壬基-脱氧野尻霉素DNJ和N-壬基-脱氧半乳糖野尻霉素DGJ。
N-壬基-DNJ是葡糖糖苷酶抑制剂，在其作用下，病毒糖蛋白可发生错误折叠，HIVDNA在细胞内储存，HIV释放减少。
N-壬基-DGJ并非葡萄糖苷酶抑制剂，但却有更强的抗HIV疗效，它们不干扰葡萄糖苷酶活性，也无细胞毒性。
可能是通过干扰前基因组RNA衣壳形成，加速病毒核心颗粒降解，影响前基因组RNA逆转录而发挥作用。
此外，它们能抑制病毒核心蛋白与导致核蛋白错误装配和稳定的特异细胞因子间的相互作用。
DNJ对肿瘤转移的抑制作用：
TsutomuTsuruoka等以小鼠β-16肺黑色细胞肿瘤为模型，研究了与野尻霉素A相关的衍生物及其类似物的抗肿瘤转移活性，指出DNJ是野尻霉素的结构类似物，它对肿瘤转移的抑制率是80％，并阐明了抗肿瘤转移活性与抗糖苷酶和抗p-葡萄糖苷酶活性的可能关系，认为DNJ对肿瘤转移的抑制机理可能是DNJ通过抑制糖苷酶的活性在肿瘤细胞表面产生未成熟的碳水化合物链，削弱了肿瘤的转移能力。
这些表面活性发生改变的肿瘤细胞被寄主免疫系统攻击而使这些肿瘤细胞并不能结合到寄主细胞上。
但其详细的作用机理还不清楚，有待于进一步的研究。
经研究表明，DNJ及其衍生物具有降糖，抗病毒等作用，且具有毒性小，服用安全等优点。
桑叶中DNJ及其衍生物具有很多的药理作用，如：
降糖作用，抗病毒等作用。
且毒性小，服用安全，DNJ是α-葡萄糖苷酶的有效抑制剂，它能通过降低碳水化合物的消化和葡萄糖的吸收来降低食后高血糖。
所以，DNJ可用于治疗糖尿病的发作，肥胖症和相关的机能紊乱。
很多公司研制的减肥产品，其主要成分是桑叶，利用的就是桑叶中的DNJ对二糖类分解酶活性的抑制作用，从而抑制小肠对双糖的吸收从而达到减肥的效果。
作为抗糖尿病的新药开发利用应具有广阔前景，也可以生产一些针剂和口服液等。
因此从桑叶中提取、分离、纯化得到DNJ,并建立其含量测定的方法,对于研制糖尿病治疗的新药及开发桑叶相关产品具有非常重要的学术意义和实用价值。
2材料与仪器
2.1材料
试验材料由湖南农业大学生化与分子生物学研究室提供的桑叶粉末。
2.2设备和仪器
1100高效液相色谱仪（VWD检测器）（美国AgilentTechnologies）,全波长检测仪（美国AgilentTechnologies），754型紫外检测器（美国AgilentTechnologies），C18（150mm×4.6mm,5u）茎向加压柱，（杭州科博仪器有限公司），AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），eppendorfcentrifuge5417R，DK-S24恒温水箱（上海精宏实验设备有限公司），涡流混合器等。
2.3试剂
0.05mol/LHCl，0.4mol/L硼酸盐（PH8.5），5mmol/LFMOC-Cl（含50％乙腈），1％醋酸，蒸馏水等。
3.方法与步骤
3.1桑叶样品的制备
精确称取桑叶粉末30mg于EP管中，加入0.05mol/LHCl溶液1mL后，于涡流混合器上涡流1min,然后放入超声波清洗器超声处理40min，放到离心机里，12000r/min离心30min后，取上清液，将沉淀物重复以上步骤抽提一次，合并两次上清液，定容至2mL。
即得到样品提取液。
3.2DNJ标准液的配制
称取DNJ标准品（DNJ-HCl）于容量瓶中，加入0.05mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀得1mg/mL的DNJ标准液。
3.3DNJ的衍生化
取桑叶粉末提取液140uL于EP管中，加入0.4mol/L的硼酸盐（PH8.5）169uL，再加入5mmol/L的衍生化试剂FMOC-Cl（含50％乙腈）250uL，混合后，25℃恒温水浴中反应20min，再加入1％的醋酸溶液66uL，加入82uL蒸馏水，。
3.4高效液相色谱测定
采用HPLC法测定，流动相配比为甲醇：
0.1％醋酸为55:
45.检测波长为265nm。
流速为0.8mL/min,定量方法采用外标法，进样量为20uL。
测定相应时间DNJ的峰面积。
算出DNJ的含量。
3.5精密度实验
精确吸取同一份桑叶粉末同一次处理衍生化反应溶液20uL，在上述色谱条件下重复进样5次，分别测定相应时间DNJ的峰面积值。
填入一下表格。
计算相对标准偏差RSD。
从而判断该实验的精密度。
实验编号
1
2
3
4
5
RSD
峰面积（mv.sec）
3.6稳定性实验
将衍生化的提取液置于4℃的冰箱中保存。
精确吸取同一份桑叶粉末同一次衍生化反应溶液20uL，在上述色谱条件下重复进样6次，分别在0,2,4,8,12,24h进样。
分别测定相应时间DNJ的峰面积值。
填入一下表格。
计算相对标准偏差RSD。
从而判断该实验的稳定性。
时间（h）
0
2
4
8
12
24
RSD
峰面积（mv.sec）
3.7重现性实验
精确称取5份桑叶粉末，分别按上述方法进行HPLC分析后，进样20uL。
分别测定相应时间DNJ的峰面积值。
填入一下表格。
计算相对标准偏差RSD。
从而判断该实验的重现性。
试验编号
称样量（g）
峰面积（mv.sec）
含量（mg）
平均含量（mg）
RSD
1
2
3
4
5
3.8回收率实验
精确吸取3份已知DNJ含量的桑叶提取液140uL，分别加入1uL，3uL，5uL的DNJ对照品。
分别加入0.4mol/L的硼酸盐（PH8.5）169uL，再加入5mmol/L的衍生化试剂FMOC-Cl（含50％乙腈）250uL，混合后，25℃恒温水浴中反应20min，加入87uL蒸馏水，再加入1％的醋酸溶液66uL后进样20uL。
分别测定相应时间DNJ的峰面积值。
填入一下表格。
计算相对标准偏差RSD。
计算回收率和平均回收率。
编号
样品量
样品含量
标准加入量（uL）
测量值
回收率（％）
平均回收率（％）
RSD（％）
1
1
2
1
3
3
4
3
5
5
6
5
4.结果与分析
4.1标样高效液相图谱
从标样色谱图可以看出DNJ的保留时间为9.983min，此时出现色谱峰。
4.2样品高效液相图谱
从样品的色谱图发现，样品的保留时间为9.952min。
样品的保留时间相对于标样的保留时间（9.983min），有所提前，DNJ与其他杂质也得到了了良好的分离。
4.3标准曲线的制备
分别精密配取浓度为1uL,3uL,5uL,7uL,9uL的1mg/L的DNJ标准液，按照上述衍生化方法进行衍生，取反应液在上述色谱条件下进行分析,以色谱峰面积（Y）与标准品浓度（X）绘制标准曲线。
结果表明,DNJ的浓度与色谱峰面积呈明显的线性关系,经回归分,二者的回归方程为Y=215.14X+103.08，R2=0.9957
4.4精密度实验结果
按上述精密度实验测得各提取液的峰面积如下
精密度实验结果
Theexperimentalresultoftheprecision
实验编号
1
2
3
4
5
RSD
峰面积（mv.sec）
444.9
445.2
444.0
443,9
445.0
0.14％
计算得到RSD为0.14％。
表明该实验精密度好。
4.5稳定性实验结果
按上述稳定性实验测得各提取液的峰面积如下
稳定性实验结果
Theexperimentalresultofthestablleness
时间（h）
0
2
4
8
12
24
RSD
峰面积（mv.sec）
457.3
459.7
456.3
458.7
456.8
457.6
0.28％
计算得到RSD为0.28％。
表明该实验中DNJ与FMOC衍生化产物在24小时内稳定性好。
4.6重现性实验结果
按上述重现性实验测得各提取液的峰面积如下
重现性实验结果
Theexperimentalresultoftherepeat
试验编号
称样量（g）
峰面积（mv.sec）
含量（mg/g）
平均含量（mg/g）
RSD
1
0.0354
451.8
0.771
2
0.0329
449.7
0.770
3
0.0329
452.1
0.771
0.770
0.27％
4
0.0306
449.9
0.770
5
0.0307
451.3
0.770
计算得到样品的平均含量为0.770mg/g。
而计算得到的RSD为0.27％。
表明该实验的重现性好。
4.7回收率实验
按上述回收率实验测得各提取液的峰面积如下
编号
样品量（g）
样品含量（mg）
标准加入量（mg）
测量值
回收率（％）
平均回收率（％）
RSD（％）
1
0.0354
0.0231
0.001
0.0241
100％
101.4％
1.94％
2
0.0329
0.0230
0.001
0.0240
100％
3
0.0329
0.0232
0.003
0.0263
103.3％
4
0.0306
0.0230
0.003
0.0261
103.3％
5
0.0307
0.0231
0.005
0.0282
102％
6
0.0311
0.0233
0.005
0.0283
100％
计算得到平均回收率为101.4％，RSD为1.94％，此结果表明，本此顶方法符合加样回收率的要求。
5.讨论
由于DNJ是一种不带发色基团的小分子含氮化合物,在紫外和可见光波段内无吸收峰,不能直接用HPLC-UV进行检测分析。
我们以FMOC-Cl作为衍化试剂,在一定的条件下DNJ与FMOC-Cl反应可以生成DNJ-FMOC络合物,该物质是一种荧光物质,相关报道均采用荧光检测。
其特点是灵敏度较高,但检测器价格昂贵。
本试验采用紫外检测,灵敏度虽稍低于荧光检测,但经过改进衍生化反应体系中试剂的加入量,反应产物经HPLC分离后,DNJ-FMOC完全能够用紫外检测器检测,且目标色谱峰分离效果好,峰面积与DNJ浓度呈高度正相关关系,从精密度、稳定性、重现性、回收率的测定结果来看,本方法是稳定可靠的,灵敏度完全可以满足一般桑叶粉中DNJ测定的要求。
因此,本方法可作为测定桑叶中DNJ含量的有效方法。
更为重要的是由于一般高效液相色谱仪上均配备紫外检测器,所以本测定方法更易于推广普及,具有更大的实用性。
为提高测定的准确性和可靠性,本方法在实际应用过程中需要注意以下问题。
首先,对桑
叶粉中DNJ的提取,选用0.05mol/LHCl溶液为溶剂,在室温下涡流1min,再用超声波处理40min,提取2次,DNJ的提取率可达99%以上,并且加样回收率也高达101.4%,均达到了理想的效果。
若不经过超声波处理,则提取率明显降低。
其次,DNJ-FMOC络合物在室温非酸性条件下不稳定,半衰期大约只有3d。
提高DNJ-FMOC络合物的稳定性,对于获得准确的测定结果是极其重要的。
本试验在DNJ与FMOC-Cl衍生化反应后,用1%的醋酸进行稀释,得到了稳定的检测结果。
试验中发现,缓冲液的pH值对衍生化反应影响较大,在pH8.5的硼酸盐缓冲液中进行反应效果最佳。
再次,FMOC-Cl试剂的存放时间对衍生化反应的影响也很大,建议现用现配。
受DNJ-FMOC络合物稳定性的限制,衍生化反应体系的存放时间对测定结果有很大影响,反
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