液相问题解答.docx

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液相问题解答

流动相使用前为什么要脱气？

流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。

气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。

溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。

若用FLD，可能会造成荧光猝灭。

常用的脱气方法比较：

氦气脱气法：

利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。

加热回流法：

效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。

抽真空脱气法：

易抽走有机相。

超声脱气法：

流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。

在线真空脱气法：

Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。

为什么溶剂和样品要过滤?

溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。

色谱柱：

由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。

仪器：

溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。

样品过滤头的类型：

30mm内径：

适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。

处理样品体积少于50μl。

13mm内径：

适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。

3mm内径：

适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。

处理样品体积为7μl。

滤膜类型：

聚四氟乙烯滤膜：

适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。

醋酸纤维滤膜：

不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。

尼龙66滤膜：

适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。

再生纤维素滤膜：

具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。

流动相：

1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；

2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；

3、使用双泵时，最好不要有机相与水相直接调用，这样可能造成管路气泡，最好我们根据自己的需要配制一定浓度的有机相与水相的混合溶液，再与水相混合调用

4、换流动相后，要purge

样品：

1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；

2、用流动相或比流动相弱的溶剂制备样品溶液，若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小，尽量用流动相制备样品液；手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；

色谱柱：

1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；2、使用符合要求的流动相；

3、使用保护柱；

4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。

5、色谱柱在不使用时，应用甲醇或乙氰冲洗，取下后紧密封闭两端保存；

6、不要高压冲洗柱子；

7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱，使用硅胶柱时还要特别小心流动相的PH范围在2~8之间；使用过程中注意轻拿轻放。

8、上柱时我们要注意柱子的方向，千万不要装反了

高效液相色谱法的分类及其分离原理

高效液相色谱法分为：

液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。

1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）

固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。

①液-固色谱法的作用机制

吸附剂：

一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。

　　流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应：

　　X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相）

　　其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。

　　吸附反应的平衡常数K为：

　　K值较小：

溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。

　　K值较大：

表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。

　　发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。

②液-固色谱法的吸附剂和流动相

常用的液-固色谱吸附剂：

薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

一般规律：

对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。

对流动相的基本要求：

　　试样要能够溶于流动相中

　　流动相粘度较小

　　流动相不能影响试样的检测

常用的流动相：

甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。

③液-固色谱法的应用

常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。

2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）

将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。

①液-液色谱法的作用机制

溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。

液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：

K=C固/C液

K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。

②正相色谱和反相色谱

正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。

反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。

正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。

③液-液色谱法的固定相

常用的固定液为有机液体，如极性的β，β′氧二丙腈（ODPN），非极性的十八烷（ODS）和异二十烷（SQ）等。

缺点：

涂渍固定液容易被流动相冲掉。

采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。

使固定浓与担体之间形成化学键，例如在硅胶表面利用硅烷化反应：

形成Si-O-Si-C型键，把固定液的分子结合到担体表面上。

优点：

　　化学键合固定相无液坑，液层薄，传质速度快，无固定液的流失。

　　固定液上可以结合不同的官能团，改善分离效能。

　　固定液不会溶于流动相，有利于进行梯度洗提。

④液-液色谱法的应用

液-液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。

化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子质量不同，均可以用液-液色谱进行分离。

3.离子交换色谱法

原理：

离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换，由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力（作用力）而被分离。

①离子交换色谱法的作用机制

聚合物的分子骨架上连接着活性基团，如：

-SO3-，-N（CH3）3+等。

为了保持离子交换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X，称为反离子。

活性基团上的反离子可以与流动相中具有相同电荷的被测离子发生交换：

离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱过程。

交换达到平衡时：

K值越大，保留时间越长。

②溶剂和固定相

两种类型：

多孔性树脂与薄壳型树脂。

多孔性树脂：

极小的球型离子交换树脂，能分离复杂样品，进样量较大；缺点是机械强度不高，不能耐受压力。

薄壳型离子交换树脂：

在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂，这种树脂柱效高，当流动相成分发生变化时，不会膨胀或压缩；缺点是但柱子容量小，进样量不宜太多。

③离子交换色谱法的应用

主要用来分离离子或可离解的化合物，凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离。

广泛地应用于：

无机离子、有机化合物和生物物质（如氨基酸、核酸、蛋白质等）的分离。

4.凝肤色谱法（空间排阻色谱法）

凝胶是一种多孔性的高分子聚合体，表面布满孔隙，能被流动相浸润，吸附性很小。

凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。

①凝胶色谱法的作用机制

体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱；小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，然后又从孔隙中出来随载液流动，后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。

凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。

②凝胶色谱法的固定相

软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。

③凝胶色谱法的应用特点

保留时间是分子尺寸的函数，适宜于分离相对分子质量大的化合物，相对分子质量在400～8×105的任何类型的化合物。

保留时间短，色谱峰窄，容易检测。

固定相与溶质分子间的作用力极弱，趁于零，柱的寿命长。

不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上时才能得到分离

高效液相色谱的类型

（一）吸附色谱

　　在吸附色谱中，样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非极性烃基几乎不予保留。

所以，要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位置。

通常，样品能用吸附色谱分离的应是能溶解于有机溶剂并是非离子型的，强离子样品是不适宜的。

　　吸附色谱所使用的流动相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作为基础，按照样品的极性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的浓度为１０％或更少一些。

如有可能，可进一步减小百分数。

因为高浓度的醇会减少填料的吸附活性，减弱吸附能力，并使重现困难。

（二）分配色谱

　　１.正相分配色谱

　　正相分配色谱适用于不溶于水而溶于有机溶剂且带有极性基团的样品，但正相分配色谱不适合于离子型物质。

　　２.反相分配色谱

　　这种方法目前应用非常广泛，应用的范围也很广，在反相分配色谱中，样品的非极性部分起保留作用。

　　通过使用的流动相是水—甲醇和水—乙腈，通过加入甲醇或乙腈的量的不同来调节分离，但如果样品带有离子型基团，需要在流动相中加入盐或调节流动相的ＰＨ值，例如，如果样品有一个—ＣＯＯＨ基团，使流动相的ＰＨ值是偏向酸性的，由于抑制了—ＣＯＯＨ基团的电离而加强了保留。

这个方法叫离子抑止法，如果样品有强离子基，有时候采用在流动相中加入适当抗衡离子以形成离子对的离子对法。

　　在调节ＰＨ值中，保持ＰＨ值在填料说明书手册中所规定的范围内，大多数化学键式的二氧化硅使用在ＰＨ＝２-９，然而，当加入盐以后，最好使其ＰＨ＝７.５-８或更小的，多孔聚合物填料能应用非常广泛的ＰＨ值。

（三）离子交换色谱

这个方法是用填料的固定相的离子交换基团和样品的离子基团之间的离子交换来分离样品组分的，按照所交换的离子分成阳离子交换和阴离子交换。

　　离子交换色谱使用于能溶于水的离子型物质。

在离子交换色谱中，流动相的盐的浓度、ＰＨ及盐的种类等都对保留值有很大的影响。

在高效液相色谱的离子交换中所用的盐有磷酸盐、醋酸盐和硼酸盐。

因为氯化物会腐蚀不锈钢仪器，在高效液相色谱中不能使用ＮａＣＩ或其他的氯化物盐类。

根据测量波长有些盐也不能使用，例如，醋酸吸收大约在２１０ｎｍ，当检测处在短波端的时候，用醋酸作流动相是不合适的。

（四）凝胶色谱

　　凝胶色谱不同于以上三种分离方法。

凝胶色谱是根据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。

这个方法也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。

具有一定孔径