农药登记毒理学代谢和毒物动力学试验.docx

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农药登记毒理学代谢和毒物动力学试验

农药登记毒理学代谢和毒物动力学试验

1　范围

GB/T15670的本部分规定了代谢和毒物动力学试验的基本原则、方法和要求。

本部分适用于为农药登记而进行的代谢和毒物动力学试验。

2　规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB14925实验动物环境及设施

3　术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1　

毒物动力学toxicokinetics

研究化学物质在体内量变规律的科学。

它从速度论的观点出发，研究化学物质在吸收、分布、生物转化和排泄过程中随时间发生的量变规律，用数学模式系统地分析和阐明化学物质在体内的位置、数量与时间的关系，探讨这种动力学过程与毒作用强度和时间的关系。

3.2　

速度rate

机体或机体某部位在单位时间内转运或消除化学物质的量或浓度的变化，用dx/dt表示。

对恒速过程，可用平均速度△x/△t表示。

单位是mg·h-1或μg·min-1。

3.3　

速率常数rateconstant

机体或机体某部位化学物质转运或消除的速度与该部位化学物质的量或浓度的比值，即（dx/dt）/X。

单位是时间的倒数h-1或min-1。

3.4　

零级速度过程zeroorderrateprocess

化学物质转运或消除的速度与化学物质的量或浓度的零次方成正比，即（dx/dt）=KX0。

因为X0＝1，所以（dx/dt）＝K，即零级速度过程就是恒速过程，与化学物质的量或浓度无关，可用速度来衡量。

3.5　

一级速度过程firstorderrateprocess

化学物质转运或消除的速度与化学物质的量或浓度的一次方成正比，即（dx/dt）=KX1，可用速率常数来衡量，单位为时间的倒数即h-1或min-1。

3.6　

混合速度过程mixorderrateprocess

化学物质转运或消除的速度过程随化学物质的量或浓度而变。

当化学物质的量或浓度高时，运转或消除的机能被饱和，呈零级速度过程；化学物质的量或浓度随时间降到一定水平后，呈一级速度过程。

混合速度过程可用（dx/dt）=VmaxC/（Km+C）表示。

3.7　

毒-时曲线和毒-时半对数曲线

以时间为自变量，毒物的数量特征为应变量所作的算术坐标图为毒-时曲线，以毒物的数量特征的自然对数为应变量所作的图为毒-时半对数曲线。

它们除能反映毒物在体内的配置状态、毒物量的经时变化和速度特征外，毒-时曲线下面积还能反映进入体循环的毒物量。

毒-时半对数曲线可被用作按残数法求解毒物动力学参数的工具。

3.8　

房室和房室模型compartmentandcompartmentmodel

在毒物动力学研究中，为研究和数学推导的方便，将机体划分成若干“部分”，将动力学即速度特征相似的体液、脏器、组织划归同一“部分”，并称之为房室。

它只是毒物动力学中的抽象划分，不一定有直观的生理解剖学意义。

它描述了毒物在体内的配置状况。

把各房室借助各种流向速度串接起来，构成一种反映毒物配置的具有速度论特征的模型称为房室模型。

它是毒物动力学研究中的主要模型。

3.9　

吸收absorption

化学物质由染毒部位或经染毒途径进入体循环的过程。

3.10　

分布distribution

进入体循环的化学物质向机体各可分布的体液、组织、脏器转运的过程。

3.11　

代谢metabolism

进入体内的化学物质在体液pH、酶系统或肠道菌丛等的作用下发生化学结构变化的过程。

代谢又称生物转化。

3.12　

排泄excretion

已被吸收的化学物质和/或其代谢产物排出体外的过程。

3.13　

消除elimination

化学物质原形从机体或机体某部位消失的过程，它是所有的代谢和排泄作用的总和。

3.14　

生物利用度bioavailability

化学物质由染毒部位进入体循环的速度（即吸收速度）和程度（吸收的相对量，吸收率）。

3.15　

表观分布容积apparentvolumeofdistribution

化学物质在体内的分布达动态平衡后，体内化学物质的量与血浆中该化学物质浓度的比值，即V＝Xt/Ct，单位是L·kg-1或mL·kg-1。

它不是一个真实的生理或解剖学空间，只具有表观的意义，它反映化学物质在体内分布的广度。

3.16　

生物半减期biologicalhalflife

化学物质在体内的量或浓度减少一半所需的时间，单位是h或min。

4　试验目的

代谢和毒物动力学研究的主要目的在于了解、阐明、测定受试物（有时包括其代谢产物）的下述内容：

——进入机体的途径，吸收的速度和程度（生物利用度）；

——在体内各脏器、组织和体液间的分布特征，与血浆蛋白的可逆性结合；

——生物转化的速度和程度，鉴定主要代谢产物的化学结构，探索生物转化的通路；

——消除或排泄的途径、速度和能力；

——在体内蓄积的可能性及其程度和持续时间；

——比较不同剂量水平，单次和多次重复染毒时吸收、分布、生物转化和消除或排泄的动力学特征；

——比较不同种属、品系动物间毒物动力学的异同，为根据动物资料外推到人提供可能的依据；

——寻找富集的脏器、组织，探索它们与作用靶器官之间的关系；

——探索毒物动力学过程与毒效强度和时间的关系；

——为其他毒性、毒理学试验选择动物、剂量提供有益的资料。

综合上述试验结果，将可能为阐明受试物在人体内的转归、毒作用的机理、安全性评价、卫生标准制定乃至改善中毒的防、诊、治提供科学依据。

5　试验概述

受试物通过恰当的途径染毒。

根据研究的目的对一组或几组实验动物分别给予一次染毒或在规定的时间内重复多次染毒。

然后按研究的要求，测定体液、脏器、组织、排泄物中受试物和/或其代谢产物的量或浓度的经时变化。

进而选择或提出受试物在体内配置的合适的模型和数学表达式，进行毒-时曲线拟合，求出有关的毒物动力学参数，探讨其毒理学意义。

代谢和毒物动力学研究涉及多种不同类型、不同深度的研究领域，不能要求对每一个受试物都进行以下所有的各项试验。

具体的研究内容和项目将取决于研究的目的和受试物的种类、用途、预期人类可能接触的广度、理化性质、毒性和毒理学特征、以及建立适用的生物样品中受试物分离、测定方法的实际可能性等因素。

但无论怎样，研究的结果应对受试物的吸收、分布、生物转化、消除或排泄的特征有一个基本的阐明。

6　试验方法

6.1　受试物

受试物的纯度不应低于98%。

如果采用放射性同位素标记的受试物，其放化纯度不应低于95%。

如杂质含量≥20%，应对杂质的种类和含量进行分析鉴定。

应将放射性同位素标记在受试物分子的骨架上或具有重要功能的基团上。

在某种情况下，受试物的分子上有多个部位被同种或异种同位素标记，对探讨该受试物的生物转化是有益的。

如只观察生物样品中总放射活性的动态变化，由于不能确定所测的是什么化学物质，因此除了能获得一个总放射活性的表观消除半减期外，其他毒物动力学参数都可能是不可靠的。

当然，对由此而引出来的任何结论都必须持慎重的态度。

为满足染毒剂量的需要，可将受试物溶解或均匀悬浮于适当的溶媒或介质中。

6.2　实验动物

动物种类和品系的选择

可用一种或数种实验动物进行代谢和毒物动力学研究。

尽可能选用与人类具有相似代谢途径的种系或选用与其他毒理学试验相同、并能出现受试物典型毒作用的动物。

选择受试动物还应考虑到最好能在同一动物身上取得完整的毒-时曲线。

一般首选大鼠，但根据试验的需要也可选用其他动物。

年龄和体重

一般应选用初成年动物。

选用啮齿类动物时，试验开始时实验动物体重的个体差异不超过同性别平均体重的±20%。

有特殊需要时，可设不同的年龄组。

性别和数量

性别

一般对实验动物的性别不作硬性规定，如毒性、毒理研究表明有明显的性别差异时，应设不同的性别组。

一般情况下，雌性动物应选用未经产和未妊娠的。

数量

每一试验组不应少于4只动物，在用非啮齿类动物的试验中，动物数量可酌情减少。

在研究受试物组织分布等需要处死动物的试验中，开始时试验组的大小应考虑到采样的时间点数和每一时间点需处死的动物数。

当选用小动物时，为满足采样量，可将处理完全相同的3只～5只动物的生物样品混在一起，作为一个试验点来处理。

每个剂量组至少应重复4次。

饲养条件

实验动物的饲养条件应符合GB14925的有关规定。

进行代谢和排泄试验时，应将每只动物或作为一个试验点的处理完全相同的3只～5只小动物各自置于单独的代谢笼中，以便分别收集尿和粪。

有条件或需要时还可收集动物的呼出气体。

一般选用常规的实验室饲料，饮水不限。

但是，无论采用何种饲料，应给出饲料的配方，并应注意各组分对受试物毒物动力学影响的可能性。

试验前动物要在实验饲养条件下检疫和适应3d～5d。

6.3　生物样品中受试物的分离和测定方法

生物样品中受试物和/或其代谢产物的分离和测定方法的建立是毒物动力学试验的前提。

对分析测定方法的要求是专一性强，灵敏度高[最低检出浓度应能达到（10-9～10-12）g·mL-1或（10-9～10-12）g·g-1水平]，线性范围宽，准确度高（回收率应高于75%），精密度好（批间变异系数应小于10%）。

应用放射性同位素标记的受试物时，应根据标记同位素射线的性质建立相应的测定放射活性的方法。

放射活性的测定应结合层析等分离技术进行，以了解代谢产物的图谱、生物转化程度和速度。

6.4　染毒

染毒剂量

单次染毒试验至少需要选用两个剂量水平。

低剂量应相当于未观察到有害作用剂量水平（NOAEL）。

高剂量应能出现毒性作用或引起毒物动力学参数的改变，但不会引起严重中毒，保证在取得完整的毒-时曲线之前动物不会死亡，或不会引起影响试验结果评价的过高死亡率，一般可选用0.5LD50～0.75LD50。

反复多次染毒试验时，通常低剂量水平就能满足要求，但在某些情况下，也还需要设置高剂量水平组。

当用放射性同位素标记的受试物染毒时，应考虑到所用剂量中放射活性的强度，低剂量水平应能满足最低检出限，高剂量水平应防止放射性损伤所致的毒物动力学特征的改变。

染毒途径

染毒途径要尽可能地与人类实际接触的情况相似。

最好选用与其他毒理学试验相同的染毒途径，可能时染毒方式也应相同。

根据试验的目的和要求可采用经口、经皮或吸入染毒。

为了解受试物的毒物动力学基本特征或为计算血管外途径染毒吸收程度提供参数，经静脉注射染毒是必要的。

吸入染毒时，染毒期尽可能使受试物的实际浓度保持恒定，应控制其日内、日间的变异系数小于±20%。

经皮肤染毒时，应注意染毒面积、染毒密度、实验室温度、湿度、风速等因素对受试物毒物动力学的影响。

经口染毒可采用灌胃、吞服胶囊、随饲料或饮水饲毒的方式进行，应注意这些不同的方式可能给毒物动力学带来的影响。

采用饲毒的方式染毒时应注意剂量的准确度。

当应用溶媒或其他介质时，应注意它们对受试物毒物动力学的影响。

6.5　生物样品的采集

合理安排采样时间和观察期限是获得完整的毒-时曲线和良好的计算素材的关键。

观察期限要求长于4.5个生物半减期（95%受试物被消除），不应短于3个生物半减期（87.5%受试物被消除）。

准时采样，每一时相的采集时点应多于3个，否则计算所得的参数可能是不可靠的。

血样最好从动脉采取，总采血量勿超过动物血容量的1/10。

尿样用连续分段集尿法采集，在集尿期中点设采血点，以便计算肾清除率。

脏器组织样品应采用放血的方法处死动物后剖取，防止因血液淤滞影响脏器组织中受试物的定量测定结果。

被观察的脏器组织的种类，原则上越全越好，但至少应包括：

血、心、脑、肝、肾、肺、脾、骨骼肌、脂肪组织和可能的靶器官组织。

对有生殖、胚胎毒性的受试物，还应包括生殖器官、胎盘、羊水和胎儿。

为动态观察，取样时点最好不少于4个。

样品的采集、贮存和预处理过程中，由于酶或非酶活性物质的作用、污染和挥发等，可影响受试物的测定结果，应事先摸清规律，采取防范措施。

7　观察项目

7.1　静脉注射血受试物浓度动态变化和毒物动力学基本特征分析

单次不同剂量受试物（或其放射性同位素标记物）静脉注射染毒后，于不同时间测定血浆中受试物浓度（或总放射活性强度），绘制毒-时曲线和毒-时半对数曲线，分析速度类型和动力学模型等基本特征。

常见的毒物动力学模型有：

静注一房室模型、静注二房室模型、静注三房室模型等。

用残数法或非线性最小二乘回归法拟合毒-时曲线，计算毒物动力学参数。

拟合和计算可选用适当的统计软件进行。

与单次静脉注射染毒相关的毒物动力学参数主要有：

a）反映分布速度的毒物动力学参数：

分布速率常数α、π（h-1或min-1）

半分布期t1/2α、t1/2π（h或min）

b）反映分布广度的毒物动力学参数：

一房室模型表观分布容积V（L·kg-1）

多房室模型中室表观分布容积Vc（L·kg-1）

多房室模型周室表观分布容积Vp（L·kg-1）

c）反映体内毒物量的毒物动力学参数

染毒后t时血毒物浓度Ct（mg·L-1或μg·mL-1）

毒-时曲线下面积AUCiv或

iv（μg·h·mL-1）

d）反映消除速度的毒物动力学参数

消除速率常数k、β（h-1或min-1）

生物半减期t1/2、t1/2β（h或min）

e）反映消除能力的毒物动力学参数：

机体总清除率CLT（L·kg-1·h-1）

7.2　吸收

经消化道吸收

经口染毒后，于不同时间测定血浆中受试物浓度，根据血毒-时资料分析速度类型和动力学模型。

常见的毒物动力学模型有：

一级吸收一级消除的一房室模型和一级吸收一级消除的二房室模型。

计算与经口染毒相关的毒物动力学参数：

a）反映吸收速度的毒物动力学参数：

吸收入血的时滞t0（h或min）

吸收速率常数ka（h-1或min-1）

半吸收期t1/2ka（h或min）

血毒物浓度达峰时间tp（h或min）

b）反映吸收程度的毒物动力学参数：

非静注毒-时曲线下面积AUCNiv或

Niv（μg·h·mL-1）

血毒物浓度峰值Cmax（mg·L-1或μg·mL-1）

吸收率（可利用的剂量分数）F，

经口染毒后，观察消化道及其内容物中受试物的动态消除过程，估算受试物经消化道的吸收速度和吸收程度。

动态观察经口染毒后肝门静脉、后腔静脉（或颈总动脉）血中受试物及其代谢产物的浓度，确定有无肝脏首过作用及其程度。

测定胆汁中受试物及其代谢产物，向十二指肠灌入含受试物或其代谢产物的胆汁后测定血中受试物，确定有无肝-肠循环。

经皮肤吸收

经皮肤染毒后，于不同时间测定血浆中受试物浓度，根据血毒-时资料分析速度类型和动力学模型。

必要时还需结合皮下注射染毒进行上述研究。

单次经皮肤或皮下注射染毒常见的毒物动力学模型也是一级吸收一级消除模型。

因此也可计算与经口染毒相同的毒物动力学参数。

动态观察受试物或放射性同位素标记物在皮肤表面的消失过程、在皮肤的滞留量，研究、估算受试物经皮肤吸收的速度和程度。

利用离体皮瓣测定受试物穿透皮肤的能力和速度及在皮肤表面蒸发逸散的速度和程度。

经呼吸道吸收

测定吸入气和呼出气中受试物的浓度Ci和Ce（mg·L-1），并根据实验动物的通气量Vr（L·min-1）、体重W（kg）和染毒持续时间T（min）计算受试物经呼吸道的滞留率（见式1）、滞留速度常数（见式2）和吸入染毒滞留剂量（见式3）。

………………………

（1）

式中：

Rd——滞留率；

Ci——吸入气中受试物的浓度，单位为毫克每升（mg·L-1）；

Ce——呼出气中受试物的浓度，单位为毫克每升（mg·L-1）；

Kd=Ci·Rd·Vr/W………………………

（2）

式中：

Kd——滞留速度常数，单位为毫克每千克每分（mg·kg-1·min-1）；

Ci——吸入气中受试物的浓度，单位为毫克每升（mg·L-1）；

Rd——滞留率；

Vr——实验动物的通气量，单位为升每分（L·min-1）；

W——实验动物体重，单位为千克（kg）；

Dinhd=Kd·T………………………（3）

式中：

Dinhd——滞留剂量，单位为毫克每千克（mg·kg-1）；

Kd——滞留速度常数，单位为毫克每千克每分（mg·kg-1·min-1）；

T——染毒持续时间，单位为分（min）。

吸入染毒开始后，于不同时间测定血浆中受试物浓度，根据血毒-时资料用Wagner-Nelson（适用于一房室模型）或Loo-Rieglman（适用于二房室模型）的待吸收百分数-时间作图法分析受试物经呼吸道吸收的速度类型。

如待吸收百分数的自然对数对时间呈直线关系，提示受试物呈表观一级速度过程吸收，该直线的斜率即是吸收速率常数ka。

如待吸收百分数对时间在算术坐标中呈直线关系，则提示受试物呈零级速度过程吸收，该直线的斜率就是零级吸收速度常数k0。

根据血毒-时资料用非线性最小二乘回归分析法拟合毒-时曲线，计算毒物动力学参数。

吸入染毒常呈现为零级吸收一级消除的一房室模型或二房室模型。

7.3　分布

根据血毒-时资料测定与分布速度、广度有关的毒物动力学参数，如分布速率常数α、π，半分布期t1/2α、t1/2π和表观分布容积V，中室表观分布容积Vc和周室表观分布容积Vp等。

染毒后不同时间处死动物，剖取各主要脏器组织，测定它们的重量、脏器系数、受试物的浓度。

计算靶组织和非靶组织的毒-时曲线下面积（AUC

）T和（AUC

）NT或毒重量-时间曲线下面积（AUQ

）T和（AUQ

）NT。

通常以血液为非靶组织计算各脏器组织的靶向系数te（见式4）、总靶向系数Te（见式5）、重量-平均靶向系数t

（见式6）或重量-平均总靶向系数T

（见式7），阐明受试物的脏器组织分布特征，寻找富集的脏器组织，探讨它们与靶器官的关系，判断物质蓄积的程度、广度和持续时间。

靶向系数

……………………（4）

总靶向系数Te=

……………………（5）

重量-平均靶向系数t

=

……………………（6）

重量-平均总靶向系数T

=

……………………（7）

用整体放射自显影技术，定性、定量观察受试物及其代谢产物在脏器、组织中的动态分布。

需要时，测定受试物与血浆蛋白的结合率。

7.4　生物转化

根据受试物的化学结构和文献资料，估计可能的代谢产物。

为测定受试物的生物转化程度和方式，应采用适当的，如紫外光谱、红外光谱、薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、核磁共振、放射性薄层扫描等技术方法，对血、尿、粪、胆汁等生物样品中的代谢产物进行分离、纯化、浓缩、分析、测定和鉴定。

并应用预测的代谢物纯品作标准确认结构鉴定。

阐明代谢产物的结构和代谢途径。

体外试验，如动态观察受试物在离体灌流脏器标本、脏器组织切片的培养制备、体液或脏器组织的匀浆、亚细胞制备中的生物转化过程，包括观察诱导或抑制某些代谢酶系的活性对这些过程的影响，可能有助于了解受试物的代谢场所和探索代谢转化通路。

7.5　消除与排泄

根据血毒-时资料测定与消除速度有关的毒物代谢动力学参数，如消除速率常数K、β（h-1或min-1）、生物半减期t1/2、t1/2β（h或min）、机体总清除率CLT（L·kg-1·h-1）等。

染毒后不同时间连续分段收集尿、粪、呼出气，必要时还包括胆汁，测定其中的受试物及其代谢产物的量，直到所给剂量的95%已被消除、或在上述样品中已检测不到受试物、或检测已长达7d为止。

了解受试物及其代谢产物的排泄途径和速度。

根据血和尿中受试物测定资料，测定肾清除率Q（L·kg-1·h-1）、肾排泄速率常数ke（h-1或min-1）等。

必要时，需测定哺乳期授乳动物乳汁中的受试物及其代谢产物，了解它们经乳汁排泄的情况。

8　研究的时机

8.1在急性毒性、毒理研究的后阶段，开始建立分离、分析、测定生物样品中受试物和/或其代谢产物的方法，进行染毒后血内受试物浓度经时变化的观察和毒物动力学分析。

阐明受试物吸收、分布、消除等基本毒物动力学特征。

8.2在短期重复染毒毒性和深入的毒理学研究阶段，开展单次和多次重复染毒条件下受试物和/或其代谢产物在机体各主要脏器组织和体液间的动态分布和排泄的研究，阐明脏器分布特征、富集脏器与靶器官的关系、排泄途径和能力、物质蓄积的可能性及程度和持续性。

8.3在致突变、致畸、致癌和慢性毒性研究阶段，开展受试物穿透胎盘屏障进入羊水、胎儿体内的可能性和程度的研究。

应创造条件开展受试物生物转化途径、主要代谢产物结构鉴定等工作。

9　试验结果和评价

9.1　结果处理

用表格形式汇集试验数据，内容应包括不同染毒组每只动物的编号、性别、体重、染毒剂量、染毒前后生物材料中受试物及其代谢产物的测定值（或放射活性强度）等原始数据。

计算各剂量组上述测定值的均值及标准差。

画出不同染毒条件下的毒-时曲线及毒-时半对数曲线。

计算不同染毒条件下与吸收、分布、代谢转化、消除或排泄有关的各项毒物动力学参数。

对试验数据、曲线拟合和计算结果用适当的统计学方法处理。

对进行了生物转化研究的，给出代谢产物的化学结构，并提出代谢途径。

9.2　结果评价

根据试验结果对受试物进入机体的途径、吸收的速度和程度，受试物及其代谢产物在脏器、组织和体液中的分布特征，生物转化的速度和程度、主要代谢产物和生物转化通路，排泄的途径、速度和能力，受试物及其代谢产物在体内蓄积的可能性、程度和持续时间作出评价。

结合相关学科的知识对各种毒物动力学参数进行毒理学意义的评价。

10　试验报告

试验报告至少应包括以下内容：

a）试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号；

b）试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况；

c）试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期；

d）试验摘要；

e）受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或含量）、剂型、生产日期（批号）、理化性质、配制所用溶剂或介质及配制方法等，如系放射性同位素标记化合物，还应注明放射性同位素种类、标记部位、放化纯度和比放射活性；

f）实验动物种属、品系、级别、数量、体重、性别、来源（供应商名称、实验动物质量合格证号、实验动物生产许可证号），检疫和适应情况，实验动物饲养环境，包括温度、相对湿度、饲料、单笼饲养或群饲、实验动物设施使用许可证号；

g）详细介绍生物样品中受试物和/或其代谢产物分离、纯化、浓缩和分析测定的方法及其专一性、灵敏度、准确度和精密度等，对测定放射活性强度的方法，必须注明仪器的计数效率；

h）动物的分组情况及对照物的选择，染毒开始时间、结束时间、染毒的途径和方式、剂量水平的选择，生物样品的种类，采样时间和持续观察的时间；

i）汇集各观察项目结果的数据表格，各项计算方法及结果，绘出毒-时曲线和毒-时半对数曲线，给出主要代谢产物的化学结构，并提出代谢转化通路；

j）结果的评价；

k）原始记录保存情况的说明。