PCR常见问题分析及对策.docx

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PCR常见问题分析及对策

PCR常见问题分析及对策（无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性）

问题1：

无扩增产物

现象：

正对照有条带，而样品则无

原因:

1.模板:

含有抑制物，含量低

2.Buffer对样品不合适

3.引物设计不当或者发生降解

4.反应条件：

退火温度太高，延伸时间太短

对策:

1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量

2.更换Buffer或调整浓度

3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物

4.降低退火温度、延长延伸时间 

问题2：

非特异性扩增

现象：

条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带

原因：

1.引物特异性差

2.模板或引物浓度过高

3.酶量过多

4.Mg2+浓度偏高

5.退火温度偏低

6.循环次数过多

对策：

1.重新设计引物或者使用巢式PCR

2.适当降低模板或引物浓度

3.适当减少酶量

4.降低镁离子浓度

5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法

6.减少循环次数 

问题3：

拖尾

现象：

产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：

1.模板不纯

2.Buffer不合适

3.退火温度偏低

4.酶量过多

5.dNTP、Mg2+浓度偏高

6.循环次数过多

对策：

1.纯化模板

2.更换Buffer

3.适当提高退火温度

4.适量用酶

5.适当降低dNTP和镁离子的浓度

6.减少循环次数 

问题4：

假阳性

现象：

空白对照出现目的扩增产物

原因：

靶序列或扩增产物

的交*污染

对策：

1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；

2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管 

及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存  

PCR产物的电泳检测时间

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：

①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：

需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：

通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：

变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：

如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：

选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：

一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：

①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。

③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

④适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：

①减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量，减少循环次数。

克隆PCR产物的最优条件是什么？

最佳插入片段：

载体比需实验确定。

1：

1（插入片段：

载体）常为最佳比，摩尔数比1：

8或8：

1也行。

应测定比值范围。

连接用5ul2X连接液,50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。

室温保温1小时，或4oC过夜。

在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。

室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。

PCR产物是否需要用凝胶纯化？

如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。

如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。

少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。

为此需在克隆前做凝胶纯化。

如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？

A）涂布未转化的感受态细胞。

如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。

B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。

例如，将1ug/ul质粒1:

100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。

用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。

培养过夜，产生1000个菌落。

转化率为：

产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。

具体而言转化用10ngDNA，用SOC稀释到1000u后含10ngDNA，用1/10铺板，共用1ngDNA。

转化率为：

1000克隆X10（3次方）ng/铺板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。

C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ug感受态细胞），表明载体失去T。

可能是连接酶污染了核酸酶。

T4DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4DNA连接酶替换。

D）用pGEM-T或pGEM-TEasy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑,没有菌落或少有菌落，连接有问题。

对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？

A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4oC过夜。

B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。

为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。

如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。

如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-TEasy载体3`-T缺失。

C）插入片段不适于连接。

用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。

UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。

D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-TEasy载体克隆所需。

加TaqDNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。

详情查pGEM-TpGEM-TEasy载体技术资料（TM042）。

E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞

PCR疑难解答

当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：

将PCR反应的试管与反应板紧贴。

当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。

不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。

对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。

没有扩增产物：

在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。

泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。

检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。

检查模板和引物的用量。

增加循环次数和/或模板DNA的用量。

泳道中出现模糊条带：

减少循环次数或模板DNA的用量。

提高退火温度，但不要超过68℃。

重新设计引物或设计更长的引物。

其他值得注意的条件：

建议使用0.2-ml薄壁管。

厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。

最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。

大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。

建议使用1.75mmol/LMgCl2∶350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2∶500mmol/LdNTP组合的混合物。

然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。

基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。

因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。

DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。

要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。

请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。

降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。

使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。

这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

变性：

第一步变性在94℃下进行2分钟。

在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。

这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12kb时，应该尽可能的降低变性温度。

延伸：

68--72℃下进行延伸操作。

循环延伸：

尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。

长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。

若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。

测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。

引物设计：

一般长度20-30bp；

至少50%的GC含量；

避免引物二聚体和二级结构；

引物对的Tm值应该接近。

也可下列图示提示找到解决问题的突破口：

PCR实验操作程序

1.在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：

反应物加样顺序体积（μl）终浓度

去离子水129.4

10×BufferB251×

4×dNTP混合物35各200μmol/L

MgCl2431.5mmol/L

有义引物52.60.25μmol/L

反义引物62.60.25μmol/L

模板720.1μg

TaqDNA聚合酶80.41unit

2.  用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50μl矿物油。

每加一管换一次Tip。

3.  振荡每只管，然后短暂离心。

4.  将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：

预变性94℃4分钟1次

变性94℃1分钟

退火37-65℃1分钟

延伸72℃1分钟

循环30次

终延伸72℃7分钟1次

保存4℃

5.  将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。

电泳条件：

60-80V,15-20分钟。

6.  紫外分析仪检查电泳结果。

四、讨论

1.假阴性，不出现扩增条带

　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

　　模板：

①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

③模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。

　　酶失活：

需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

　　引物：

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

　　Mg2+浓度：

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　反应体积的改变：

通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

　　物理原因：

变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：

如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

2.假阳性

　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

　　引物设计不合适：

选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

3.出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：

一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：

①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。

③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

④适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

4.出现片状拖带或涂抹带

　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：

①减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量，减少循环次数。

PCR常见问题的精辟总结--耶鲁大学

TroubleshootingforPCRandmultiplexPCR

TroubleshootingdiscussionisbasedonthePCRprotocolasdescribedinthetablebelow.Allreactionsarerunfor30cycles.

COMPONENT

VOLUME

FINALCONCENTRATION

1.autoclavedultra-filteredwater（pH7.0）

20.7µL

-

2.10xPCRBuffer*

2.5µL

1x

3.dNTPsmix（25mMeachnucleotide）

0.2µL

200µM（eachnucleotide）

4.primermix（25pmoles/µLeachprimer）

0.4µL

0.4µM（eachprimer）

5.TaqDNApolymerase（nativeenzyme）

0.2µL

1Unit/25µL

6.genomicDNAtemplate（100ng/µL）

1.0µL

100ng/25µL

*The10xPCRbuffercontains:

500mMKCl;100mMTris-HCl（pH8.3）;15mMMgCl2（thefinalconcentrationsoftheseingredientsinthePCRmixare:

50mMKCl;10mMTris-HCl;1.5mMMgCl2）.

QUESTIONS

SOLUTIONS

1.Iget（many）longerunspecificproducts.WhatcanIdo?

Decreaseannealingtime

Increaseannealingtemperature

Decreaseextensiontime

Decreaseextensiontemperatureto62-68ºC

IncreaseKCl（buffer）concentrationto1.2x-2x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mM.

IncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.

Takelessprimer

TakelessDNAtemplate

TakelessTaqpolymerase

Ifnoneoftheaboveworks:

checktheprimerforrepetitivesequences（BLASTalignthesequencewiththedatabases）andchangetheprimer（s）

Combinesome/alloftheabove

2.Iget（many）shorterunspecificproducts.WhatcanIdo?

Increaseannealingtemperature

Increaseannealingtime

Increaseextensiontime

Increaseextensiontemperatureto74-78ºC

DecreaseKCl（buffer）concentrationto0.7-0.8x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mM

IncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant

Takelessprimer

TakelessDNAtemplate

TakelessTaqpolymerase

Ifnoneoftheaboveworks:

checktheprimerforrepetitivesequences（BLASTalignthesequencewiththedatabases）andchangetheprimer（s）

Combinesome/alloftheabove