实时直接分析质谱法快速检测饮料和尿液中的γ羟基丁酸.docx

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实时直接分析质谱法快速检测饮料和尿液中的γ羟基丁酸

实时直接分析―质谱法快速检测饮料和尿液中的γ―羟基丁酸

　　摘要建立了一种实时直接分析-质谱法（DART-MS）用于饮料（水、碳酸饮料、啤酒）和尿液中γ-羟基丁酸（GHB）快速检测。

样品经甲醇-水（1∶1，V/V）溶液稀释后，在负离子模式下，以选择离子扫描（SIR）模式进行直接定量分析。

离子化气体温度为350℃，进样速率为0.5mm/s。

针对水样、碳酸饮料、啤酒、尿液样品，本方法的检出限（S/N=3）为1～2μg/mL，定量限（S/N=10）为3～5μg/mL。

标准曲线线性相关系数为0.9899～0.9980，加标回收率为80.8%～115.2%，相对标准偏差为1.9%～12.8%。

本方法具有样品前处理简单、分析速度快、成本低等优点，有望在大批量饮料和尿液样品的快速筛查分析中发挥作用。

　　关键词实时直接分析-质谱法；γ-?

u基丁酸；快速筛查

　　1引言

　　γ-羟基丁酸（γ-Hydroxybutyricacid，GHB）是一种常见的滥用药物，被用作镇静剂和麻醉剂，过度使用会造成暂时性失忆，甚至导致死亡。

我国和美国都将其列为管制药物。

GHB具有强烈的镇静及健忘效应，易溶于大多数液体基质中，且无色无味，因此常作迷药用于药物辅助性犯罪[1]。

对于服用GHB者，尿液中GHB浓度明显高于内生浓度水平（低于10μg/mL），因此尿液是检测GHB极具参考价值的生物样本，有必要建立快速灵敏的检测饮料和尿液中GHB的方法。

　　目前，GHB的检测方法有显色法、红外光谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、离子色谱法及核磁共振法等。

Alston等[2]用化学显色法作为初步筛选药物的方法，但该方法检出限高，且易受干扰；Witkowski等[3]采用傅里叶变换红外法（FTIR）用于GHB的快速筛查，但定量分析存在不足；色谱-质谱联用是使用最广泛的方法之一，Lenz等[4]在酸性条件下将γ-羟基丁酸（GHB）转变为γ-丁内酯（GBL），浓缩后采用顶空进样方式的气相色谱-质谱联用法（GC-MS）分析；孟品佳等[5]用五氟卞基溴烷基化衍生后，对衍生物进行了质谱解析，然而提取和衍生化的过程复杂且耗时；Busardo等[6]采用HPLC-MS/MS法检测血浆、尿液、脑脊髓液和头发中的GHB，尽管避免了GC-MS中将GHB进行内酯化或者衍生化的样品前处理问题，但仍然需要耗时的色谱分离，且使用的串联质谱价格昂贵，不利于推广。

Liu等[7]采用二维离子色谱法测定了人尿样品中GHB含量，通过离子排斥色谱柱消除尿液基质干扰，再利用柱切换技术，采用离子交换色谱柱测定GHB，由于需要对仪器进行改装，且使用实验室自制离子交换色谱柱，不利于推广。

Palomino-Schtzlein等[8]利用核磁共振对尿液和血清中的GHB进行定性和定量检测，在NMR分析中，体液中大分子重叠共振，严重干扰了GHB的检测。

Saar-Reismaa等[9]利用毛细管电泳法测定人唾液样本中的GHB，但毛细管电泳中电渗流的不稳定性经常引起迁移时间的变化。

　　实时直接分析离子源（DART）是一种新型的敞开式非表面接触型解析/离子化分析技术，可分析各形态样品，无需繁杂的前处理和冗长的色谱分离过程，分析速度为秒级，可实现对目标物的实时定性与定量分析[10]。

Bennett等[11]将DART与飞行时间质谱仪（TOF）联用，检测饮料中GHB；Chen等[12]将DART与四极杆-轨道离子阱质谱（Q-Orbitrap）联用，用于检测包括GHB在内的多种街头药物。

但上述工作均未进行GHB的准确定量分析，且未涉及尿液样本的检测；同时，飞行时间质谱和四极杆-离子阱质谱比单四极杆质谱价格昂贵，测试成本高，不利于普及使用。

　　本研究采用实时直接分析-单四极杆质谱法，建立了快速检测饮料及尿液中的GHB的方法。

本方法无需复杂的样品前处理过程，分析速度快，且单重四极杆质谱成本相对较低，体积小，更易于推广，饮料及尿液样本的同时测定更利于刑事案件的侦查。

　　2实验部分

　　2.1仪器与试剂

　　实时直接分析离子源DARTSVP（美国IonSense公司）；ACQUITYQDa质谱检测器（美国Waters公司）；3K15离心机（德国Sigma公司）、UPR-II-5T超纯水仪（四川优普超纯科技有限公司）、VX-200涡旋搅拌器（美国Labnet公司）、AR223CN电子天平（美国Ohaus公司）、KH7200DB型超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）。

　　甲醇（色谱纯，德国Merck公司），实验用水为经UPR-II-5T超纯水仪制备的超纯水；γ-羟基丁酸（美国Cerilliant公司）。

3种饮料样品购于当地超市，分别为水、无色碳酸饮料和啤酒；尿液样品由志愿者提供。

　　2.2溶液配制

　　称取GHB标准品0.01g（精确到0.001g），以超纯水溶解并定容至10mL，配制成1000μg/mL的单标储备液，于4℃保存。

使用前以甲醇-水（1∶1，V/V）稀释成不同浓度的标准溶液。

　　碳酸饮料、啤酒的标准溶液：

取碳酸饮料和啤酒各10μL，加入适量标准储备液，用990μL甲醇-水（1∶1，V/V）稀释成不同浓度的标准溶液。

　　模拟样品的配制：

在空白样品中添加适量的标准溶液，制得不同浓度的阳性样品。

配制的模拟水样中GHB浓度约为20、40和80μg/mL，以甲醇稀释1倍后进样；碳酸饮料和啤酒中GHB浓度约为1000、2000和4000μg/mL，以甲醇-水（1∶1，V/V）稀释100倍后进样；尿液中GHB浓度约为200μg/mL，以甲醇-水（1∶1，V/V）稀释10倍后进样。

　　2.3样品前处理

　　饮料：

水样取500μL，加入500μL甲醇，过0.22μm滤膜后进样；对于碳酸饮料和啤酒，取10μL样品，加入990μL甲醇-水（1∶1，V/V）稀释，经0.22μm滤膜过滤后检测。

　　尿样：

取尿样100μL，加900μL甲醇-水（1∶1，V/V），涡旋混匀，以10000r/min离心5min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后检测。

　　2.4实时直接分析离子源条件和质谱条件

　　负离子模式采集数据，离子化气体为高纯氦气，氦气的流速为3L/min，气体离子化温度为350℃；采用12Dip-itSamplers模式进样，用玻璃棒蘸取适量溶液置于自动进样架上，待溶液挥干后进样，进样速率为0.5mm/s，栅极电压为200V，离子源出口距质谱进口约2.4cm。

在负离子模式下，选择离子扫描模式（SIR）采集数据，锥孔电压为8V，母离子m/z103.3。

　　3结果与讨论

　　3.1?

|谱条件的优化

　　在选择离子扫描模式下，分别采用正离子模式和负离子模式对GHB进行一级质谱分析，得到其分子离子峰。

如图1所示，GHB在正负离子模式下均有响应，但在负离子模式下GHB的信号强度明显优于正离子模式，因此本研究选择负离子模式进样。

在此条件下，优化锥孔电压，使分子离子峰达到最大响应值，最终确定锥孔电压为8V。

　　3.2DART条件的优化

　　3.2.1离子化温度DART利用高温激发态的等离子体对待测样品进行解吸离子化，因此离子化温度是需要优化的重要参数。

温度过高或过低，都会影响DART的离子化效率和背景噪音。

高温会加速待测样品的热解吸率，使更多的待测样品进入质谱检测器，进而增强响应。

然而，过高的温度会导致待测样品在热解吸过程中降解，降低灵敏度[13]。

本研究考察了离子化气体温度在300～450℃范围内对GHB离子化效率的影响，发现离子化温度为350℃时，信号响应最高，如图2所示。

　　3.2.2样品传输速度DART软件能控制线性轨道上dip-it玻璃棒的移动速度，玻璃棒蘸取待测样品后引入质谱仪分析。

玻璃棒通过电离区域的速度对样品信号响应强度有较大的影响。

本研究考察了样品传输速度为0.2、0.5和0.8mm/s时GHB的峰形和离子响应强度。

如图3所示，当样品传输速度较慢时，有利于离子化气体与样品充分接触，从而提高离子化效率，但峰形变宽。

综合考虑峰形、分析速度及离子响应强度等因素，最终确定以0.5mm/s的速度进行样品传输。

　　3.3方法学考察

　　水样的基质较为简单，用甲醇-水（1∶1，V/V）稀释1倍后直接进行分析。

碳酸饮料和啤酒的基质成分较复杂，在制作标准曲线时应考虑基质效应。

基质效应的评价公式为：

基质效应=（1-基质空白溶液的加标信号强度/空白溶剂的加标信号强度）×100%[14]。

经计算碳酸饮料和啤酒的基质效应>15%，故以空白碳酸饮料和啤酒为溶剂配制一系列不同浓度的GHB标准溶液。

由于碳酸饮料中含有较多的糖类，样品黏度大，而啤酒中的成分较为复杂，基质浓度过高时，样品液膜太厚，可能无法实现目标分析物的瞬间气化，直接进样后得到的选择离子流图出现了裂峰现象。

本实验采用甲醇-水（1∶1，V/V）稀释碳酸饮料和啤酒样品，考察稀释倍数（10、20、50和100倍）对峰形及信号响应的影响。

结果表明，稀释100倍后直接进样可以消除选择离子流图的裂峰现象。

　　尿液样品通过甲醇-水（1∶1，V/V）稀释10倍后进样，结果表明，尿液的基质效应小于15%，属于低基质效应影响，故在实际定量分析过程中采用与水样相同的标准曲线。

　　饮料（水、碳酸饮料、啤酒）和尿液的工作曲线方程如表1所示，其线性范围均为5～100μg/mL，线性相关系数R>0.98，方法的相对标准偏差为4.1%～5.7%，检出限（S/N=3）为1.0～2.0μg/mL，定量限（S/N=10）为3.0～5.0μg/mL。

　　3.4模拟样品分析

　　在实际的刑事案件中，饮料中GHB的浓度范围在1.7～21.1mg/mL之间[11]。

由于阳性的实际样品难以获取，本实验通过加标的方式配制模拟阳性样品。

在适量饮料样品中添加GHB标准品，使饮料中GHB的含量分别约为1000、2000和4000μg/mL。

对于刑事案件中的尿液样品，Bosman等[15]报道在疑似药物服用的不同案件中尿液样品中GHB浓度范围为14～2000μg/mL。

LeBeau等[16]也报道了一例疑似药物辅助性犯罪（DFSA）案件中，尿液中GHB的浓度为308μg/mL。

采用在阴性尿液中添加GHB标准品的方式配制模拟阳性尿液样品，使尿液中GHB的含量约为200μg/mL。

按照2.3节的方法对上述配制的模拟样品进行简单前处理后，进行检测。

　　稀释后的模拟阳性样品测得的质谱图见图4，测得的GHB浓度如表2所示。

加标回收率在80.8%～115.2%之间，相对标准偏差为1.9%～12.8%，表明本方法具有较好的准确度和重现性。

　　4结论

　　本研究建立了一种饮料和尿液中快速筛查GHB的DART-MS方法，样品前处理过程简单快速，操作方便，可对实际饮料样品（水、碳酸饮料、啤酒）以及尿液中的GHB进行快速筛查，且DART-MS仪器成本低，体积小。

本方法可应用于现场快速检测，可为司法鉴定中涉及GHB的案件提供技术支持。

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