《细胞工程》讲义.docx

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《细胞工程》讲义

细胞工程讲义

第一章绪论

细胞生物学研究细胞基本生命活动规律的科学，它在不同层次研究细胞结构与功能，细胞增殖、分化、衰老与凋亡，信号传递，真核细胞基因表达与调控，细胞起源与进化等为主要内容。

细胞工程就是人们按照自己的愿望，通过各种物理和化学手段改造细胞的结构、调控细胞功能与生理活动过程，以期更好地创造特定功能或用途的细胞、组织器官、新物种或新产品来满足人们的需要。

1.1生物工程（生物技术）

生物技术是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。

生物技术的内涵主要是：

（1）运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；

（2）工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；（3）模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品；（4）发展相应的科学理论与工程技术。

主要技术范畴包括：

基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；生化工程

现代生物技术特征：

多学科性；商业性；规模化

1.2细胞工程的概念及研究范畴

细胞工程（cellengineering）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。

广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。

动物细胞工程包括：

细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；细胞融合技术；

胚胎工程技术（核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆）。

植物细胞工程包括：

植物组织培养技术；器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养技术；亚细胞水平的操作技术等。

1.3细胞工程与其它相关学科的关系

1．细胞工程学科的建立依赖于相关学科理论的发展

2．为生物学研究提供新的实验体系

3．细胞工程必须与其它生物技术相结合才能更好地发挥作用

1.4植物细胞工程的发展

植物细胞工程是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性学科。

在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。

植物细胞工程是在植物组织培养的基础上发展起来的，因此，植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。

一．探索阶段

在这一阶段中，细胞学说的产生和细胞全能性学说的提出为组织培养技术的产生奠定了理论基础。

在这些理论的指导下所开展的有关试验，对组织培养技术的建立进行了有益的探索。

Schleiden和Schwann分别于1838年和1839年提出“细胞学说”（celltheory）。

Schwann在1839年更明确的指出：

“如果具有与有机体内一样的条件时，每个细胞应该可以独立生活和发展”。

德国著名植物学家G.Haberlandt在细胞学说的基础上于1902年提出“细胞全能性学说”。

他认为，高等植物的组织、器官可以不断分割，直到单个细胞。

如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能力，那么，可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个体。

二．培养技术建立阶段

作为一门技术，它必须具有一定的程序性。

也就是说，它应该具有一定的技术模式。

在这一阶段，植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式，一是培养基模式，二是激素调控模式。

3．应用研究阶段

1.组织培养领域的研究迅速在世界各国的有关实验室广泛展开。

2.技术体系更加完善。

这一阶段的技术体系包括：

根据不同的培养目的外植体的取材和灭菌方法，不同外植体及其培养产物的培养程序，适合于不同植物种类和外植体类型的培养基等。

3.形成了较为完整的理论体系。

在植物组织培养研究的基础上，植物细胞工程现已形成了以细胞全能性为基本理论基础，以细胞脱分化和再分化调控为中心的理论体系。

4.研究目的性更加明确，并已广泛应用到生物科学研究的各个领域，以细胞工程为基础的新型生物技术产业正在兴起。

四．植物细胞工程应用

育种上：

将常规技术与植物组培技术相结合，可获得常规技术难以或无法获得的种质材料，缩短育种周期，提高育种效率。

快速获得特殊倍性材料；克服远缘杂交不亲和；克服杂种胚早期夭折；导入外源基因；突变体筛选；种质资源保存；细胞培养生产有用次生产物；在细胞生物学和发育生物学研究中的应用；在植物遗传、生理生化以及植物病理等基础研究中的应用。

1.5动物物细胞工程的发展

一．融合现象的发现

19世纪30年代，Muller,Schwann,Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象，但当时并没有引起人们关注，认为这只是一种特殊现象。

1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象，1855年～1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。

至此，自然界中广泛存在着多核细胞的事实，才被生命科学工作者接受。

1859年，A.Barli在研究黏虫生活史时发现，某些黏虫存在着由单个细胞核融合形成多核的原生质团的情况。

据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。

二.动物组织细胞培养技术的建立

1907年，美国胚胎学家R.Harrison将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且还从细胞中长出了轴突（神经纤维）细胞，解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的可能性。

他所采用的把培养物放在盖玻片上并置于凹玻片腔中培养的方法还一直沿用至今。

Carrel（1911）发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应，还把无菌技术引到了组织培养技术中。

作为他的技术标志是，他在不含抗菌素的培养条件下使鸡胚心脏细胞维持生存了34年，先后继代3400次，证明动物细胞有可能在体外无限地生长。

1914年，Thomson创立了另一条完全不同的体外组织培养途径－器官培养法，以后又被Strangeways和Fell所发展。

1940年，Eadrle建立了可以无限传代的一个C3H小鼠的结缔组织细胞系－L系。

二是1951年，Gay建立了第一个人体细胞系－人体宫颈癌Hela细胞系。

三.细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生

1958年,Okada发现紫外灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。

由于仙台病毒能稳定地诱发细胞融合而引起了许多科学家的兴趣。

60年代，Harris（1965）诱导不同的动物体细胞融合获得成功并能存活下来。

Lifflefield（1964）根据亲本细胞的酶缺陷型，利用HAT选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断地增殖，从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。

这一技术在此后广泛地应用于遗传学、病毒学、免疫学、细胞学等多种学科的研究工作中

1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。

该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。

这一技术的诞生把细胞融合技术从实验阶段推向了应用研究阶段，促进了动物细胞工程的蓬勃发展。

四.动物克隆技术的建立

1891，Heape等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果，他们把安哥拉家兔胚胎移植给比利时兔，得到了4只安哥拉家兔。

30年代以后，先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。

经过几十年的不断完善和充实，已成为一项比较成熟的繁殖生物学技术。

首例克隆动物成功的报道1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵（经紫外线照射杀死卵细胞核）中，约有1％的重组卵发育成为成熟蛙。

这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于：

实验证明了完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息，并能在一定的条件下发育成动物个体，从而证明了动物细胞仍然具有全能性；初步建立了体细胞核移植的实验体系，证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期，卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中的mRNA与有关的蛋白质。

克隆羊的诞生

1997年2月，英国科学家Wilmut等在世界权威杂志《Nature》上首例报道了世界第一只克隆羊的诞生。

它的贡献在于：

实验证明了哺乳动物高度分化的细胞同样含有全套遗传信息，亦能在一定条件下发育成动物个体，进一步证明了动物细胞的全能性。

多利诞生的技术路线：

取6岁供体羊乳腺细胞—血清饥饿培养使细胞处于G0期；经GnRH处理取卵细胞—移去卵细胞的细胞核；将培养的乳腺细胞的核移植到去核的卵细胞中；重组细胞植入第一受体羊输卵管中培养至胚泡期（桑椹胚）；桑椹胚再移植入第二受体羊子宫内发育至分娩。

1.6细胞工程的主要研究内容

细胞工程涉及的领域相当广泛，根据研究对象不同，可以将细胞工程分为微生

物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程三大类。

一、动植物细胞与组织培养

动植物细胞与组织培养可分为三个层次上的培养：

细胞培养、组织培养和器官培养。

植物细胞的大规模培养要早于动物细胞。

动物细胞培养技术可用于制取许多有应用价值的细胞产品，如多种单克隆抗体、疫苗、生长因子等。

二、细胞融合

采用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞（或原生质体）融合为—个细胞。

用于产生新的物种或品系（植物上用得多，动物上用得少）及产生单克隆抗体。

细胞融合最大的贡献是在动植物、微生物新品种的培育力面。

三、染色体工程

染色体工程是按人们的需要来添加、削减或替换生物的染色体的一种技术。

染色体工程技术最大的价值体现在新品种的培育，主要是单倍体与多倍体育种方面。

四、胚胎工程

这项技术主要是对哺乳动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，获得人们所

需要的成体动物。

胚胎工程采用的新技术包括胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外受精技术、胚胎培养、胚胎移植以及性别鉴定技术、胚胎冷冻技术等。

五、细胞遗传工程

主要包括克隆和转基因技术。

前者主要是指无性繁殖。

后者是指将外源基因整合到生物体内，得到稳定表达，并使该基因能稳定地遗传给后代的实验技术。

1.7细胞工程的重要应用

优质植物快速培育与繁殖；动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种；利用动植物细胞培养生产活性产物、药品；新型功植物品种的培育；供医学器官修复或移植的组织工程；转基因动植物的生物反应器工程；珍稀动植物资源的保存与保护；在遗传学、发育学等领域的理论研究；在能源、环境保护等领域的应用

第二章细胞工程基础

2.1细胞生物学基础

2.1.1有丝分裂

2.1.2减数分裂

减数分裂和染色体知识与植物育种

染色体联会相关知识：

染色体；同源染色体；染色单体；姊妹染色体；非姊妹染色体；染色体联会和交换

染色体联会：

偶线期又称为配对期（Pairingstage）。

配对过程是专一性的，仅发生于同源染色体之间，非同源染色体之间不进行配对。

配对以后，两条同源染色体紧密结合在一起所形成的复合结构，称为二价体（bivalent）,有4条染色单体，因而又称为四分体（tetrad）。

同源染色体配对的过程称为联会（synapsis）

2.2植物育种知识

2.2.1有性杂交培育新品种

最传统的育种方法。

自然界存在的一种特殊的细胞融合方式。

生物基因通过花粉细胞在不同