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PCR论文

4个甘蔗品种叶绿体DNAtrnL-F基因的扩增及序列分析

摘要：

为了对广西地区4个甘蔗品种进行研究分析，对其进行了叶绿体DNAtrnL-F基因的扩增以及对其产物直接测序分析。

结果表明：

4个甘蔗品种的trnL-F基因测序结果，长度约在900bp，而变异范围为895bp到901bp。

聚类分析表明四个甘蔗样品分为两支，其中一支为桂南亚08/162，另一支包括桂南亚08/163、桂南亚08/194和新台糖22，其中桂南亚08/163和新台糖22的同源性最大，它们之间有相近的亲缘关系。

关键词：

甘蔗；PCR扩增；cpDNAtrnL-F基因；直接测序  

GeneAmplificationandSequencingAnalysisofcpDNAtrnL-FFeneinfourSpeciesofFicusSaccharum

Abstract：

Inordertotheregionof foursugarcanevarietiesofresearchandanalysisinguangxi.TheDNAtrnL-Fgeneamplificationoftheirproductsanddirectsequencinganalysis.DirectsequencedresultsshowthattheirlengthaveragedofthefourkindsoftrnL-Fgeneproductswas900bp,Variationrangefrom895bp to901bp.Clusteringresultsshowsthatthefoursugarcanesamplesaredividedintotwogroups.guinanya08/162isaspecificandthreeothersugarcanegatherforanotherone.Amongofthem,xintaitang22hashigherkinshipwithguinanya08/163,hassimilargeneticrelationshipbetweenthem.

Keywords：

Sugarcane;PCRamplification;cpDNAtrnL-Fgene;Directsequencing

甘蔗是一种一年生或多年生宿根热带和亚热带草本植物，属C4作物[1]。

甘蔗秆直立，粗壮多汁，表面常披白粉。

叶为互生，边缘具小锐齿状，花穗为复总状花序。

甘蔗为喜温、喜光作物，所以产于热带、亚热带地区。

甘蔗汁多味甜，营养丰富，被称作果中佳品，含有丰富的糖分、水分，还含有对人体新陈代谢非常有益的各种维生素、脂肪、蛋白质、有机酸、钙、铁等物质，对人体十分有益[4]。

甘蔗原产于印度，现广泛种植于热带及亚热带地区。

中国蔗区主要分布在广西、广东、台湾、福建、四川、云南、江西、贵州、湖南、浙江、湖北等省[2]，其中以广西分布最为广泛，占了甘蔗总量的60%。

而本实验所研究的新台糖22号、桂南亚08/162、桂南亚08/163、桂南亚08/194均采集于广西省[3]。

新台糖22号，是近年来研究培育出来的新甘蔗品种。

茎至中大茎，蔗茎均匀，节间倒圆锥形，茎皮遮光部分浅黄绿色，露光部分紫红色，无生长裂缝和木栓裂痕。

蜡粉带较厚。

芽呈卵圆形，芽沟甚为明显。

叶片深绿色，叶身中等较窄，内叶耳长披针形，外叶耳为钝三角形，根点2～3列，排列不规则。

虽然具有萌芽良好，分蘖力强；初期生长稍慢，中后期生长快速，原料蔗茎长，茎数中等，易脱叶，甘蔗基部粗大，不易倒伏及抽穗开花，内容充实。

宿根性强，耐旱力强等优良特点，但是对甘蔗绵蚜的反应为中等，易受棉蚜虫的危害而发育不良[5-6]。

而且对梢腐病、蓟马的抗性较差等缺点。

主要分布于广东、广西、海南、云南省等各个省份。

桂南亚08/162，是一种新的甘蔗品种，是由新台糖22号杂交于CP85-1491而得到的杂交品种。

具有高糖、出苗率好、分蘖多，前期生长慢，中、后期生长较快等农艺性状。

具有植株较直立，株型紧凑，生长势好；中大茎，蔗芽圆形，下离叶痕，上接或低于生长带，两侧芽翼无或窄；节间圆筒形；根带2～4排；茎色：

遮光部分绿色，曝光久后深紫色；无芽沟，蜡粉少。

叶鞘紫色或绿色，外叶耳退化，内页耳三角或长披针形；叶片绿色，挺直，尾部弯曲等形态特征。

而且相对于新台糖22号，具有抗虫性较强，耐旱等特点。

也是分布于广东、广西、海南、云南省等各个省份[7]。

桂南亚08/163，是一种新的甘蔗品种，是由新台糖22号杂交于CP88-2143而得到的杂交新品种。

具有出苗率好，分蘖率中等，前期生长慢，中、后期生长较快等农艺特征。

具有植株直立较均匀，株型紧凑，生长势好；中大茎，蔗芽三角形，下接叶痕，上平或超过生长带，两侧芽翼窄；节间圆筒形；根带2排；茎色：

遮光部分紫色，曝光久后深紫色；芽沟深且长，蜡粉少；叶鞘紫色，外叶耳退化，内叶耳长披针形或三角形。

叶片浓绿色，挺直，尾部弯曲；茎形部分呈微“之”形等形态特征[7]。

桂南亚08/194，是一种新的甘蔗品种，是由新台糖22号杂交于粤糖83-251而培育出来的新品种，植株直立均匀，整齐，株型紧凑，生长势好；大茎，蔗芽菱形或圆形，下离叶痕，上过生长带，两侧芽翼无或窄；节间圆筒形；根带2排；茎色：

遮光部分紫红色或绿色，曝光久后深紫红色；芽沟浅短，蜡粉厚。

叶鞘紫色，外叶耳退化，内叶耳长披针形或三角形，脱叶性；叶片浓绿色，挺直，中部弯曲。

而在农艺上有出苗率中等，分蘖多；早生快发，前、中期生长快，后期生长势优，不易早衰等性状[7]。

A        B        C       D

图1四个甘蔗品种的图片

A：

新台糖22号 B：

桂南亚08/163 C：

桂南亚08/194 D：

桂南亚08/162

由于新台糖22号在生理上具有一定的缺陷，例如对甘蔗棉蚜的抗性较差，所以就利用杂交技术把新台糖22号与其他品种杂交，以至于得到更好的品种，为中国的农业事业献出一份努力[8]。

因为桂南亚08/162、桂南亚08/163和桂南亚08/194是由新台糖22号分别与CP85-1491、CP88-2143和粤糖83-251杂交而得到的新品种，在形态特征上要分辨比较困难，且具有一定的局限性[9]。

而研究新台糖22号与其他三个甘蔗品种的亲缘关系，是为了在今后的育种而作研究。

这样就可以得出哪个品种与父本的关系最近，而选择有益的性状，得出更有利于人类的杂交品种。

在分子生物学发达的现今社会，分子生物学的迅速发展以及分子生物学技术的日益完善，使研究者们可通过选择不同物种和亚种中具有代表性的DNA片段进行克隆、测序，以及遗传变异和进化分析，从而在DNA水平上为某一物种的起源进化和分类提供最有力和直接的分子依据[10]。

要比较4种品种之间的亲缘关系或差异，目前运用到分子系统学上的一些常用的DNA序列包括nrDNA的18S基因、及ITS等非编码区，cpDNA的编码基因（rbcL、matK、ndhF、atpB）及非编码区序列（rpL16、rpoC1、rps16、trnL-F和trnT-L）和应用较少的mtDNA，研究表明ITS及cpDNA的非编码区序列等因其较快的进化速率多用于较低分类阶元的系统关系研究。

而本实验所用的方法是选择非核基因组的DNAtrnL-F基因作为分子标记，编码tRNA的trnL基因是位于叶绿体DNA上的一段单拷贝序列，中间被一长约390～615bp的内含子（trnLintron）分隔为两部分，由于此片段序列较短，所能提供的信息量较少，并且在结构上与trnF基因相连（两基因间有一长约160～440bp的间隔区），因此这两个非编码区序列常结合在一起分析，又因为其进化速率较快，被普遍用于确定植物属间和族间的系统发生关系[10-11]。

因此，本研究选择广西地区禾本科甘蔗属的4个种类为实验材料。

试对这4种甘蔗属植物的叶绿体DNAtrnL-F基因基因进行PCR扩增产物测序，为以形态学为基础的传统分类提供DNA分子水平的依据，探讨甘蔗属植物纯杂种之间的遗传多样性及其亲缘关系[12]。

1材料与方法

1.1材料的采集

本实验选择了广西地区的4种甘蔗品种作为研究对象。

采集新鲜的无虫害的新鲜嫩叶，用保鲜袋分装，然后放入硅胶，吸取水分；放入-20℃的冰箱中备用。

四种甘蔗的品种名称、采集地、采集人以及采集时间见表一。

表1用于cpDNAtrnL-F序列测定的名称以及采集地、采集人以及采集时间

材料名称

采集地点

采集人

样本凭证

新台糖22号

桂南亚08/163

桂南亚08/194

桂南亚08/162

广西

广西

广西

广西

刘锴栋

刘锴栋

刘锴栋

刘锴栋

2012020011

2012020012

2012020013

2012020014

1.2主要试剂

（1）2×CTAB（100mmol/L的Tris（pH8.0），1.4mol/L的NaCl，25mmol/L的EDTA，2%CTAB

（2）TE缓冲液  （3）氯仿-异戊醇（V:

V=24:

1） （4）3mol/LNaAc 

（5）70%乙醇 （6）异丙醇 （7）无水乙醇 （8）β-巯基乙醇 （9）1×TAE溶液

（10）1×TBE溶液 （11）GV核酸染料 （12）TaqDNA聚合酶（上海生工公司）

（13）dNTPs（上海生工） （14）MgCl2（15）10×Buffer （16）Marker（北京鼎国） 

（17）引物c（18）引物f

1.3主要仪器

（1）台式高速离心机（TG16A-WS型，湖南）

（2）紫外可见分光光度计（UV-2600型，上海）

（3）微量移液器（Eppendorf，德国）

（4）凝胶成像及分析系统（UVP，美国）

（5）电泳仪（DYY-5型，北京）

（6）PCR仪（BIO-RADPTC0200，美国）

（7）立式压力蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-75SII型，上海）

（8）紫外分析仪（WD-9403型，北京）

1.4实验方法

1.4.1DNA的提取方法

本实验是采取先进的2×CTAB法来提取甘蔗的总DNA。

提取DNA的步骤按以下进行：

（1）称取干燥的甘蔗叶片约0.5克，先用剪刀把叶片剪碎，置于消毒干净的研钵中，加液氮研磨成粉，约10分钟，自至粉末呈浅灰绿色。

（2）磨碎的粉末近等量地分装于6个1.5ml的微量离心管中，分别加入1ml预热（约50℃）的2×CTAB缓冲液[使用前加入0.2%（v/v）β巯基乙醇]，用力摇匀。

（3）65oC保温1小时，每隔15分钟摇匀一次，然后室温放置15分钟，其间摇动1-2次。

（4）10,000rpm离心5分钟，弃沉淀，取上清液移至新的1.5ml的离心管，加氯仿-异戊醇（V:

V=24:

1）至满管，用力摇匀。

（5）10,000rpm离心10分钟，弃沉淀，取上清液移至新的1.5ml的离心管，加氯仿-异戊醇（V:

V=24:

1）至满管，用力摇匀。

（6）10,000rpm离心10分钟，弃沉淀，取上清液,先加1/10体积预冷（4oC）的3MNaAc，再加预冷（4oC）的异丙醇至满管，将离心管轻轻翻转几次（约5秒），-20oC放置2小时以上或过夜。

（7）10,000rpm离心5分钟，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗脱2次，再用无水乙醇洗脱一次。

晾干（或用灭菌过的滤纸吸干）后，加50μL1×TE液溶解，置-20℃保存。

1.4.2DNA的检测

（1）DNA的定性检测 采用凝胶电泳方法，取提取出的总DNA5μL，与loadingbuffer混匀后点样于ρ=1%且含有GV核酸染料的琼脂糖凝胶，在1×TBE缓冲液中电泳，稳流80mA，电泳约40分钟后紫外光下检测。

（2）DNA含量测定用紫外分光光度法。

总DNA10μL，用TE稀释250倍后置于石英比色杯中，并以TE作为空白对照，用紫外分光光度计测定其260nm及280nm波长下的OD（光密度）值，根据OD260/OD280值计算样品的纯度，计算DNA含量。

1.4.3PCR扩增

使用PCR仪（BIO-RADPTC0200，美国）对提取的总DNA进行扩增。

（1）扩增引物

引物c：

5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’

引物f：

5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’

图2 cpDNAtrnL-F区扩增及测序引物在所对应序列上的相对位置（箭头表示方向）

（2）PCR反应体系

PCR扩增反应按表二的反应体系进行。

表2 PCR反应体系（以20μL反应体积为例）

成分

加入量

双蒸水

10×buffer

dNTPS（2uM）

引物c（10uM）

引物f（10uM）

Taq酶（2U/μL）

DNA模板（原液）

总体积

14.0μL

2.0μL

0.5μL

1μL

1μL

0.5μL

1.0μL

20.0μL

（3）PCR扩增程序

把配好的PCR体系放入PCR扩增仪里按以下程序进行扩增。

预变性：

97℃ 5min

变性：

94℃ 40s 

复性：

 55℃ 1.5min   42个循环[12]

延伸：

 72℃ 1.5min

后延伸：

72℃ 7min

4℃保存

（5）PCR产物的检测

采用凝胶电泳方法。

取PCR产物5μL，与loadingbuffer混匀后点样于ρ=1%且含有GV核酸染料的琼脂糖凝胶，在1×TBE缓冲液中电泳，稳流80mA，电泳约40分钟后紫外光下检测。

1.4.4PCR产物的纯化和测序

PCR产物经纯化后送往上海生工双向测序。

1.4.5序列分析和系统树构建

序列排列和比对用ClustalX软件完成，比对后用PHYLIP软件对序列进行进化分析。

2结果

2.14种甘蔗品种的总DNA的凝胶电泳结果

用2×CTAB法提取总DNA，凝胶电泳法检测结果（见图3）显示，DNA提取的总体效果较好，但出现拖尾现象，这可能是由于提取过程的机械损伤或其他认为因素所致。

M   1   2   3  4

图3 四个甘蔗品种总DNA的凝胶电泳结果图

M：

marker1：

新台糖22号2：

桂南亚08/1633：

桂南亚08/162 4：

桂南亚08/194

2.2PCR扩增产物凝胶电泳结果

甘蔗DNAtrnL-F基因PCR扩增的产物的凝胶电泳结果如下图4。

由图4的凝胶电泳结果可以看出，总体效果不错，但是依然存在明显的拖尾现象，这可能是由于提取过程的机械损伤或其他认为因素。

M  1  2  3   4  

图4四个甘蔗品种PCR扩增产物的凝胶电泳结果图

M：

marker1：

新台糖22号2：

桂南亚08/163 3：

桂南亚08/162 4：

桂南亚08/194

2.3供试材料的trnL序列的A+T和C+G含量分析

经过直接测序结果可以得出，各个甘蔗品种的A、T、C、G的排列顺序及含量。

详细结果见附录。

表3 四个甘蔗品种的碱基含量分析表

名称A%T%C%G%A+T%C+G%A+T+C+G/bp

新台糖22号34.1532.5916.2417.0266.7417.02899

桂南亚08/16333.4133.4016.5416.8766.5933.41895

桂南亚08/19433.8532.4116.4317.3166.2633.74901

桂南亚08/16233.8532.5216.7616.8766.3733.63901

平均33.8132.6816.4917.0266.4933.51899

2.4序列分析和系统树构建的结果图

用ClustalXI软件对供试的四个供试材料的序列进行序列排序和比对，比对后用PHYLIP软件对序列进行进化分析，得出四个品种的系统树构建，结果如图4。

由图4显示的聚类结果来看，四个品种大致分为两大支，其中桂南亚08/162单独为一支，亲缘关系最远；其他三个品种聚为一大支，在这支中又可分为两个聚类，桂南亚08/194单独聚为一类，桂南亚08/163、新台糖22号为另一聚类，说明它们有相近的亲缘关系。

图5四个甘蔗品种的序列系统发育树

3讨论

3.1对于4个甘蔗品种的总DNA的凝胶电泳结果的分析

对于新台糖22号以及新台糖22号与其他品种所杂交的产物桂南亚08/162、桂南亚08/163和桂南亚08/194的亲缘性和差异的电泳结果，如图2，得出4个甘蔗品种的总DNA带都差不多在同一水平，且片段大小均大于2000bp，所以这4种甘蔗品种具有亲缘性，且差异不大[12-13]。

3.2总DNA的OD值及浓度

用紫外分光光度法分别测定4个甘蔗品种总DNA的OD260值，以1OD260相当于50ng·μL-1 双链DNA为标准，计算OD260/OD280比值。

OD260/OD280比值若在1.80左右，则DNA比较纯；若大于1.80，则含有RNA;若小于1.80，则含有蛋白质，需要去除。

而本实验的出的结果，OD260/OD280比值在1.80左右，则所提取的DNA较纯，不需要作进一步的处理[14]。

3.3PCR扩增

为了进一步分析4个甘蔗品种之间的亲缘性，进行了DNAtrnL-F基因PCR扩增。

从PCR扩增产物的电泳图谱中可以看出，片段大小大致为500到750bp之间。

而新台糖22号、桂南亚08/162、桂南亚08/163均在同一水平位置上，桂南亚08/194则PCR片段比较小，且与其他三个品种不在同一水平位置上，但差异不大[15]。

本实验选择DNAtrnL-F基因序列作为分子标记，编码tRNA的trnL基因是位于DNA上的一段单拷贝序列，中间被一长约390～615bp的内含子（trnLintron）分隔为两部分，编码序列高度保守，中间间隔的非编码序列因植物种类的不同而有很大差异，有时甚至在同一种植物间也会存在异地程度的差异[16]。

图3凝胶电泳结果表明，4种甘蔗品种片段大小相差不大，则进一步说明了4个品种之间的亲缘性。

3.4甘蔗cpDNAtrnL-F基因测序结果

通过直接测序结果分析，4个甘蔗品种的测序长度约为900bp，变异范围为895bp到901bp之间，4个甘蔗品种的A+T含量比较丰富，平均占了总量的66.49%，分别为新台糖22号A+T的含量占总含量的66.74%，桂南亚08/163的为66.59%，桂南亚08/194为66.26%，桂南亚08/162为66.37%，均超过66%。

而通过系列发育系统树则可以得出，4个甘蔗品种可以分为两支，其中桂南亚08/162独立为一支，亲缘性与另外三个甘蔗品种的亲缘性最低，亲缘关系最远；而桂南亚08/194、桂南亚08/163和新台糖22号为同一分支，但是桂南亚08/163与父本新台糖22号的亲缘性最高，亲缘关系最近，则桂南亚08/163从新台糖22号中遗传到的性状最多，以此为例，为以后的杂交育种提供了数据。

参考文献

[1] 吴棉国.我国甘蔗及制品质量与技术标准的研究[D].中国农业大学.2010，5-8.

[2] 尹兴祥,张跃彬. 关于我国发展甘蔗糖业循环经济的思考[J]. 中国糖料. 2010（02）:

5.

[3] 李杨瑞，杨丽涛.20世纪90年代以来我国甘蔗产业和科技的新发展[J].广西大学甘蔗研究所.2007,11-13.

[4]罗凯.我国的甘蔗资源及其利用[D].广东省徐闻县农委.1998,6-9.

[5]王元涛.转基因甘蔗对甘蔗主要害虫及其天敌的影响[D].福建农业大学.2009,185.

[6]廖江雄.生化性状和分子标记在甘蔗育种上的应用研究[D].福建农业大学.2001，72.

[7]王伦旺,李翔,黄家雍,黎焕光,方锋学,杨荣仲,唐仕云,谭芳,黄海荣等. 16个糖能兼用甘蔗品种（系）种性比较[J]. 中国农学通报. 2010（17）:

10-11.

[8]徐良年.甘蔗杂交后代家系评价及选择[D].亚热带农业研究. 2010（03）:

7-8. 

[9]戴成就.中国植物志[M].中学科学院.科学出版社.1997.107-122.

[10]张峰.用语植物分子系统学研究的基因片段[J].山东科学.2004，17

（1）：

55-58.

[11]田欣，李德铢.DNA序列在植物系统学研究中的应用[J].云南植物研究，2002，24

（2）：

170-184.

[12]TangY.FloralmorphologyandembryosacdevelopmentinBurretiondendronkydiifolium（Tiliaceae）anditssvstematicsignificance[J].BotJLinnSoc，2009，128：

149-158.

[13]王英，徐玉成.甘蔗亲本种特异DNA序列的PCR检测及原位PCR定位的研究[J].2009，19.

[14]F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿等.精编分子生物学实验指南[M].北京：

科学出版社，1998.37-38.

[15]Anonymous.SugarCaneGrowersCooperativeofFlorida;OrsenigoAppointedToSugarCaneGrowersCooperativeBoard[J].AgricultureWeek,2011,12.

[16]彭学贤主编.植物分子生物技术应用手册.北京化学工业出版社.2006.