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1、PCR论文4个甘蔗品种叶绿体DNA trnL-F基因的扩增及序列分析摘 要：为了对广西地区4个甘蔗品种进行研究分析，对其进行了叶绿体DNA trnL-F基因的扩增以及对其产物直接测序分析。结果表明：4个甘蔗品种的trnL-F基因测序结果，长度约在900bp，而变异范围为895bp到901bp。聚类分析表明四个甘蔗样品分为两支，其中一支为桂南亚08/162，另一支包括桂南亚08/163、桂南亚08/194和新台糖22，其中桂南亚08/163和新台糖22的同源性最大，它们之间有相近的亲缘关系。关键词：甘蔗；PCR扩增；cpDNA trnL-F基因；直接测序 Gene Amplification a

2、nd Sequencing Analysis of cpDNA trnL-F Fene in four Species of Ficus SaccharumAbstract：In order to the region of four sugarcane varieties of research and analysis in guangxi.The DNA trnL-F gene amplification of their products and direct sequencing analysis.Direct sequenced results show that their le

3、ngth averaged of the four kinds of trnL-F gene products was 900 bp,Variation range from 895bp to 901bp. Clustering results shows that the four sugarcane samples are divided into two groups.guinanya08/162 is a specific and three other sugar cane gather for another one.Among of them,xintaitang22 has h

4、igher kinship with guinanya08/163,has similar genetic relationship between them.Key words：Sugar cane ; PCR amplification ; cpDNA trnL-F gene; Direct sequencing 甘蔗是一种一年生或多年生宿根热带和亚热带草本植物，属C4作物1。甘蔗秆直立，粗壮多汁，表面常披白粉。叶为互生，边缘具小锐齿状，花穗为复总状花序。甘蔗为喜温、喜光作物，所以产于热带、亚热带地区。甘蔗汁多味甜，营养丰富，被称作果中佳品，含有丰富的糖分、水分，还含有对人体新陈代谢非常有

5、益的各种维生素、脂肪、蛋白质、有机酸、钙、铁等物质，对人体十分有益4。甘蔗原产于印度，现广泛种植于热带及亚热带地区。中国蔗区主要分布在广西、广东、台湾、福建、四川、云南、江西、贵州、湖南、浙江、湖北等省2，其中以广西分布最为广泛，占了甘蔗总量的60%。而本实验所研究的新台糖22号、桂南亚08/162、桂南亚08/163、桂南亚08/194均采集于广西省3。新台糖22号，是近年来研究培育出来的新甘蔗品种。茎至中大茎，蔗茎均匀，节间倒圆锥形，茎皮遮光部分浅黄绿色，露光部分紫红色，无生长裂缝和木栓裂痕。蜡粉带较厚。芽呈卵圆形，芽沟甚为明显。叶片深绿色，叶身中等较窄，内叶耳长披针形，外叶耳为钝三角形，

6、根点23列，排列不规则。虽然具有萌芽良好，分蘖力强；初期生长稍慢，中后期生长快速，原料蔗茎长，茎数中等，易脱叶，甘蔗基部粗大，不易倒伏及抽穗开花，内容充实。宿根性强，耐旱力强等优良特点，但是对甘蔗绵蚜的反应为中等，易受棉蚜虫的危害而发育不良5-6。而且对梢腐病、蓟马的抗性较差等缺点。主要分布于广东、广西、海南、云南省等各个省份。桂南亚08/162，是一种新的甘蔗品种，是由新台糖22号杂交于CP85-1491而得到的杂交品种。具有高糖、出苗率好、分蘖多，前期生长慢，中、后期生长较快等农艺性状。具有植株较直立，株型紧凑，生长势好；中大茎，蔗芽圆形，下离叶痕，上接或低于生长带，两侧芽翼无或窄；节间圆

7、筒形；根带24排；茎色：遮光部分绿色，曝光久后深紫色；无芽沟，蜡粉少。叶鞘紫色或绿色，外叶耳退化，内页耳三角或长披针形；叶片绿色，挺直，尾部弯曲等形态特征。而且相对于新台糖22号，具有抗虫性较强，耐旱等特点。也是分布于广东、广西、海南、云南省等各个省份7。桂南亚08/163，是一种新的甘蔗品种，是由新台糖22号杂交于CP88-2143而得到的杂交新品种。具有出苗率好，分蘖率中等，前期生长慢，中、后期生长较快等农艺特征。具有植株直立较均匀，株型紧凑，生长势好；中大茎，蔗芽三角形，下接叶痕，上平或超过生长带，两侧芽翼窄；节间圆筒形；根带2排；茎色：遮光部分紫色，曝光久后深紫色；芽沟深且长，蜡粉少；

8、叶鞘紫色，外叶耳退化，内叶耳长披针形或三角形。叶片浓绿色，挺直，尾部弯曲；茎形部分呈微“之”形等形态特征7。桂南亚08/194，是一种新的甘蔗品种，是由新台糖22号杂交于粤糖83-251而培育出来的新品种，植株直立均匀，整齐，株型紧凑，生长势好；大茎，蔗芽菱形或圆形，下离叶痕，上过生长带，两侧芽翼无或窄；节间圆筒形；根带2排；茎色：遮光部分紫红色或绿色，曝光久后深紫红色；芽沟浅短，蜡粉厚。叶鞘紫色，外叶耳退化，内叶耳长披针形或三角形，脱叶性；叶片浓绿色，挺直，中部弯曲。而在农艺上有出苗率中等，分蘖多；早生快发，前、中期生长快，后期生长势优，不易早衰等性状7。A B C D图1 四个甘蔗品种的图

9、片A：新台糖22号 B：桂南亚08/163 C：桂南亚08/194 D：桂南亚08/162由于新台糖22号在生理上具有一定的缺陷，例如对甘蔗棉蚜的抗性较差，所以就利用杂交技术把新台糖22号与其他品种杂交，以至于得到更好的品种，为中国的农业事业献出一份努力8。因为桂南亚08/162、桂南亚08/163和桂南亚08/194是由新台糖22号分别与CP85-1491、CP88-2143和粤糖83-251杂交而得到的新品种，在形态特征上要分辨比较困难，且具有一定的局限性9。而研究新台糖22号与其他三个甘蔗品种的亲缘关系，是为了在今后的育种而作研究。这样就可以得出哪个品种与父本的关系最近，而选择有益的性状

10、，得出更有利于人类的杂交品种。在分子生物学发达的现今社会，分子生物学的迅速发展以及分子生物学技术的日益完善，使研究者们可通过选择不同物种和亚种中具有代表性的DNA 片段进行克隆、测序，以及遗传变异和进化分析，从而在DNA 水平上为某一物种的起源进化和分类提供最有力和直接的分子依据10 。要比较4种品种之间的亲缘关系或差异，目前运用到分子系统学上的一些常用的DNA序列包括nrDNA的18S基因、及ITS等非编码区，cpDNA的编码基因（rbcL、matK、ndhF、atpB）及非编码区序列（rpL16、rpoC1、rps16、trnL-F和trnT-L）和应用较少的mtDNA，研究表明ITS及c

11、pDNA的非编码区序列等因其较快的进化速率多用于较低分类阶元的系统关系研究。而本实验所用的方法是选择非核基因组的DNA trnL-F基因作为分子标记，编码tRNA 的trnL基因是位于叶绿体DNA上的一段单拷贝序列，中间被一长约390615bp的内含子（trnL intron）分隔为两部分，由于此片段序列较短，所能提供的信息量较少，并且在结构上与trnF基因相连（两基因间有一长约160440bp的间隔区），因此这两个非编码区序列常结合在一起分析，又因为其进化速率较快，被普遍用于确定植物属间和族间的系统发生关系10-11。因此，本研究选择广西地区禾本科甘蔗属的4个种类为实验材料。试对这4种甘蔗属

12、植物的叶绿体DNA trnL-F基因基因进行PCR扩增产物测序，为以形态学为基础的传统分类提供DNA分子水平的依据，探讨甘蔗属植物纯杂种之间的遗传多样性及其亲缘关系12。1 材料与方法1.1 材料的采集本实验选择了广西地区的4种甘蔗品种作为研究对象。采集新鲜的无虫害的新鲜嫩叶，用保鲜袋分装，然后放入硅胶，吸取水分；放入-20的冰箱中备用。四种甘蔗的品种名称、采集地、采集人以及采集时间见表一。表1 用于cpDNA trnL-F序列测定的名称以及采集地、采集人以及采集时间材料名称采集地点采集人样本凭证新台糖22号桂南亚08/163桂南亚08/194桂南亚08/162广西广西广西广西刘锴栋刘锴栋刘锴

13、栋刘锴栋20120200112012020012201202001320120200141.2 主要试剂(1)2CTAB (100mmol/L的Tris(pH8.0)，1.4mol/L的NaCl，25mmol/L的EDTA，2%CTAB(2)TE缓冲液 (3)氯仿-异戊醇（V:V=24:1） (4)3mol/L NaAc (5)70%乙醇 (6)异丙醇 (7)无水乙醇 (8)-巯基乙醇 (9) 1TAE溶液 (10)1TBE溶液 (11)GV核酸染料 (12)TaqDNA聚合酶(上海生工公司) (13)dNTPs(上海生工) (14)MgCl2 (15)10Buffer （16）Marker(

14、北京鼎国) （17）引物c （18）引物f1.3 主要仪器(1) 台式高速离心机(TG16A-WS型，湖南)(2) 紫外可见分光光度计(UV-2600型，上海)(3) 微量移液器（Eppendorf，德国）(4) 凝胶成像及分析系统(UVP，美国)(5) 电泳仪(DYY-5型，北京)(6) PCR仪(BIO-RAD PTC0200，美国)(7) 立式压力蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-75SII型，上海)(8) 紫外分析仪(WD-9403型，北京)1.4 实验方法1.4.1 DNA的提取方法本实验是采取先进的2CTAB法来提取甘蔗的总DNA。提取DNA的步骤按以下进行：（1）称取干燥的甘蔗叶片约0.

15、5克，先用剪刀把叶片剪碎，置于消毒干净的研钵中，加液氮研磨成粉，约10分钟，自至粉末呈浅灰绿色。（2）磨碎的粉末近等量地分装于6个1.5ml的微量离心管中，分别加入1ml预热(约50)的2CTAB缓冲液使用前加入0.2%(v/v)巯基乙醇，用力摇匀。（3）65 oC保温1小时，每隔15分钟摇匀一次，然后室温放置15分钟， 其间摇动1-2次。（4）10,000 rpm离心5分钟，弃沉淀，取上清液移至新的1.5ml的离心管，加氯仿-异戊醇（V:V=24:1）至满管，用力摇匀。（5）10,000rpm离心10分钟，弃沉淀，取上清液移至新的1.5ml的离心管，加氯仿-异戊醇（V:V=24:1）至满管，

16、用力摇匀。（6）10,000 rpm离心10分钟，弃沉淀，取上清液, 先加1/10体积预冷(4 oC)的3M NaAc，再加预冷(4 oC)的异丙醇至满管， 将离心管轻轻翻转几次（约5秒），-20 oC放置2小时以上或过夜。（7）10,000 rpm离心5分钟，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗脱2次，再用无水乙醇洗脱一次。晾干（或用灭菌过的滤纸吸干）后，加50L 1TE液溶解，置-20 保存。1.4.2 DNA的检测(1)DNA的定性检测 采用凝胶电泳方法，取提取出的总DNA 5L，与loading buffer混匀后点样于=1%且含有GV核酸染料的琼脂糖凝胶，在1TBE缓冲液中电泳，稳流80mA

17、，电泳约40分钟后紫外光下检测。 (2) DNA含量测定用紫外分光光度法。总DNA 10L，用TE稀释250倍后置于石英比色杯中，并以TE作为空白对照，用紫外分光光度计测定其260nm及280nm波长下的OD（光密度）值，根据OD260/OD280值计算样品的纯度，计算DNA含量。1.4.3 PCR扩增使用PCR仪(BIO-RAD PTC0200，美国)对提取的总DNA进行扩增。( 1 )扩增引物引物c：5-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3引物f：5-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3图2 cpDNA trnL-F区扩增及测序引物在所对应序列上的相对位置（箭头表示方向）(

18、 2 ) PCR反应体系PCR扩增反应按表二的反应体系进行。表2 PCR反应体系（以20L反应体积为例）成分加入量 双蒸水10buffer dNTPS （2uM）引物c（10uM）引物f（10uM）Taq酶（2U/L）DNA模板(原液)总体积14.0L2.0L0.5L1L1L0.5L1.0L20.0L( 3 ) PCR扩增程序把配好的PCR体系放入PCR扩增仪里按以下程序进行扩增。预变性：97 5min变性： 94 40s 复性： 55 1.5min 42个循环12延伸： 72 1.5min后延伸：72 7min 4保存( 5 ) PCR产物的检测采用凝胶电泳方法。取PCR产物5L，与load

19、ing buffer混匀后点样于=1%且含有GV核酸染料的琼脂糖凝胶，在1TBE缓冲液中电泳，稳流80mA，电泳约40分钟后紫外光下检测。1.4.4 PCR产物的纯化和测序PCR产物经纯化后送往上海生工双向测序。1.4.5 序列分析和系统树构建序列排列和比对用ClustalX软件完成，比对后用PHYLIP软件对序列进行进化分析。2结果2.1 4种甘蔗品种的总DNA的凝胶电泳结果用2CTAB法提取总DNA，凝胶电泳法检测结果（见图3）显示，DNA提取的总体效果较好，但出现拖尾现象，这可能是由于提取过程的机械损伤或其他认为因素所致。M 1 2 3 4图3 四个甘蔗品种总DNA的凝胶电泳结果图M：m

20、arker 1：新台糖22号2：桂南亚08/163 3：桂南亚08/162 4：桂南亚08/1942.2 PCR扩增产物凝胶电泳结果甘蔗DNA trnL-F基因PCR扩增的产物的凝胶电泳结果如下图4。由图4的凝胶电泳结果可以看出，总体效果不错，但是依然存在明显的拖尾现象，这可能是由于提取过程的机械损伤或其他认为因素。M 1 2 3 4 图4 四个甘蔗品种PCR扩增产物的凝胶电泳结果图M：marker 1：新台糖22号2：桂南亚08/163 3：桂南亚08/162 4：桂南亚08/194 2.3 供试材料的trnL序列的A+T和C+G含量分析经过直接测序结果可以得出，各个甘蔗品种的A、T、C、G

21、的排列顺序及含量。详细结果见附录。表3 四个甘蔗品种的碱基含量分析表名称 A% T% C% G% A+T% C+G% A+T+C+G/bp新台糖22号 34.15 32.59 16.24 17.02 66.74 17.02 899桂南亚08/163 33.41 33.40 16.54 16.87 66.59 33.41 895桂南亚08/194 33.85 32.41 16.43 17.31 66.26 33.74 901桂南亚08/162 33.85 32.52 16.76 16.87 66.37 33.63 901平均 33.81 32.68 16.49 17.02 66.49 33.51

22、 8992.4序列分析和系统树构建的结果图用ClustalXI软件对供试的四个供试材料的序列进行序列排序和比对，比对后用PHYLIP软件对序列进行进化分析，得出四个品种的系统树构建，结果如图4。由图4显示的聚类结果来看，四个品种大致分为两大支，其中桂南亚08/162单独为一支，亲缘关系最远；其他三个品种聚为一大支，在这支中又可分为两个聚类，桂南亚08/194单独聚为一类，桂南亚08/163、新台糖22号为另一聚类，说明它们有相近的亲缘关系。图5 四个甘蔗品种的序列系统发育树3讨论3.1 对于4个甘蔗品种的总DNA的凝胶电泳结果的分析对于新台糖22号以及新台糖22号与其他品种所杂交的产物桂南亚0

23、8/162、桂南亚08/163和桂南亚08/194的亲缘性和差异的电泳结果，如图2，得出4个甘蔗品种的总DNA带都差不多在同一水平，且片段大小均大于2000bp，所以这4种甘蔗品种具有亲缘性，且差异不大12-13。3.2 总DNA的OD值及浓度用紫外分光光度法分别测定4个甘蔗品种总DNA的OD260值，以1OD260相当于50ngL-1 双链DNA为标准，计算 OD260/OD280比值。OD260/OD280比值若在1.80左右，则DNA比较纯；若大于1.80，则含有RNA;若小于1.80，则含有蛋白质，需要去除。而本实验的出的结果，OD260/OD280比值在1.80左右，则所提取的DNA

24、 较纯，不需要作进一步的处理14。3.3 PCR扩增为了进一步分析4个甘蔗品种之间的亲缘性，进行了DNA trnL-F基因PCR扩增。从PCR扩增产物的电泳图谱中可以看出，片段大小大致为500到750bp之间。而新台糖22号、桂南亚08/162、桂南亚08/163均在同一水平位置上，桂南亚08/194则PCR片段比较小，且与其他三个品种不在同一水平位置上，但差异不大15。本实验选择DNA trnL-F基因序列作为分子标记，编码tRNA 的trnL基因是位于DNA上的一段单拷贝序列，中间被一长约390615bp的内含子（trnL intron）分隔为两部分，编码序列高度保守，中间间隔的非编码序列

25、因植物种类的不同而有很大差异，有时甚至在同一种植物间也会存在异地程度的差异16。图3凝胶电泳结果表明，4种甘蔗品种片段大小相差不大，则进一步说明了4个品种之间的亲缘性。3.4 甘蔗cpDNA trnL-F基因测序结果通过直接测序结果分析，4个甘蔗品种的测序长度约为900bp，变异范围为895bp到901bp之间，4个甘蔗品种的A+T含量比较丰富，平均占了总量的66.49%，分别为新台糖22号A+T的含量占总含量的66.74%，桂南亚08/163的为66.59%，桂南亚08/194为66.26%，桂南亚08/162为66.37%，均超过66%。而通过系列发育系统树则可以得出，4个甘蔗品种可以分为

26、两支，其中桂南亚08/162独立为一支，亲缘性与另外三个甘蔗品种的亲缘性最低，亲缘关系最远；而桂南亚08/194、桂南亚08/163和新台糖22号为同一分支，但是桂南亚08/163与父本新台糖22号的亲缘性最高，亲缘关系最近，则桂南亚08/163从新台糖22号中遗传到的性状最多，以此为例，为以后的杂交育种提供了数据。参考文献1 吴棉国. 我国甘蔗及制品质量与技术标准的研究D. 中国农业大学. 2010，5-8.2 尹兴祥,张跃彬.关于我国发展甘蔗糖业循环经济的思考J.中国糖料.2010(02):5 . 3 李杨瑞， 杨丽涛. 20世纪90年代以来我国甘蔗产业和科技的新发展J. 广西大学甘蔗研究

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