玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响.docx

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玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响

玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响

（作者:

___________单位:

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___________）

【摘要】目的:

通过比较玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞冷冻复苏、体外成熟、胚胎发育及细胞骨架的影响，寻求最佳的卵子冷冻方案。

方法：

玻璃化冷冻生殖泡期卵（GV）、成熟中期卵（MⅡ）及体外成熟卵（IVM-MⅡ），解冻复苏后，分别作体外成熟、体外受精（IVF）、胚胎培养或固定作免疫荧光标记，统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率、细胞骨架正常率。

结果：

GV冷冻组、MⅡ冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组复苏率差异无显著性（65%vs60.92%vs69.93%，P0.05）。

GV冷冻组的成熟率显著低于对照组（79.6%vs96.19%，P0.01）。

GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P0.01），且IVM-MⅡ冷冻组受精率显著低于MⅡ冷冻组（18.06%vs31.34%，P0.01）。

IVM-MⅡ冷冻组囊胚率低于MⅡ冷冻组和对照组，差异均有显著性（28.57%vs52.38%，P0.05；28.57%vs57.14%，P0.01）。

GV冷冻组染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-MⅡ冷冻组（53.85%vs26.67%，P0.05）。

IVM-MⅡ冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组，差异均有显著性（P0.05，P0.01）。

结论：

GV卵先玻璃化冷冻再体外成熟，其细胞骨架损伤较小，胚胎发育较好。

【关键词】玻璃化冷冻；卵；细胞骨架；小鼠Abstract:

Objective:

Toevaluatetheeffectsofvitrificationontheratesofsurvival，invitromaturation（IVM），developmentandcytoskeletonofmousefrozen-thawedoocytesatdifferentstagesinordertofindthemostsuitablecryopreservationprotocol.Methods:

MⅡ，GVandIVM-MⅡwerevitrified.Afterthawed，theyunderwentinvitromaturation，invitrofertilization，embryocultivationorfixedforimmunofluorescence.Theratesofsurvival，maturation，fertilization，blastulationandcytoskeletonwithnormalconfigurationwerecalculated.Results:

TherewerenosignificantdifferencesofsurvivalratesinGV，MⅡandIVM-MⅡgroup（65%vs60.92%vs69.93%，P0.05）.ThematurationrateofGVgroupwassignificantlylowerthanthoseofcontrolgroup（79.6%vs96.19%，P0.01）.ThefertilizationrateofcontrolgroupwasobviouslyhigherthanGV，MⅡandIVM-MⅡgroup（P0.01），andthatofIVM-MⅡgroupwassignificantlylowerthanMⅡgroup（18.06%vs31.34%，P0.01）.TheblastulationrateofIVM-MⅡwassignificantlylowerthanthatofMⅡandcontrolgroups，respectively（28.57%vs52.38%，P0.05and28.57%vs57.14%，P0.01）.ThereweresignificantdifferencesintherateofnormalfeatureofspindlesandchromosomesbetweenGVgroupandIVM-MⅡgroup（53.85%vs26.67%，respectively，P0.05）.TherateofcytoskeletonindexeofIVM-MⅡgroupweremuchlower，comparingwithcontrolgroup（P0.05）.Conclusion:

TherearelessinfluencesofvitrificationoncytoskeletonanddevelopmentalcapacityofGVooctyeswhentheyarevitrifiedbeforeIVM.Keywords:

vitrification；oocyte；cytoskeleton；mouse卵子冷冻能避免胚胎冷冻带来的伦理问题，而且增加供卵来源，并为那些因疾病需要切除卵巢或推迟生育的妇女提供生殖保险。

卵子结构复杂，冷冻极易造成其不可逆的病变甚至死亡，卵母细胞成熟状态也会影响卵子冷冻结果。

成熟卵子和未成熟卵因其结构不同，对冷冻的耐受性也不同。

理论上，冷冻未成熟GV卵似乎是更好的选择，但是也有报道指出GV卵对冷冻更为敏感[1-2]。

因此本研究结合胚胎学和细胞骨架指标，探讨成熟阶段对卵子冷冻结果的影响以及GV卵冷冻时机的选择。

1材料和方法1.1溶液的配制玻璃化冷冻的基础液为含20%胎牛血清（FCS）（北京中杉金桥生物技术有限公司）的磷酸盐缓冲液（PBS），体外成熟液（MEM）为含50μg/ml青霉素、75μg/ml链霉素、0.3mol/L丙酮酸钠、200mmol/L谷氨酰胺、20%FCS、0.075IU/mlFSH及1IU/mlhCG的α-MEM溶液，受精液为含4mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的KSOM液，卵裂液为含1mg/mlBSA的KSOM液，KSOM液的配制见文献[3]。

除FCS外，其余试剂均来自美国Sigma公司。

1.2实验动物昆明小白鼠，控制光照和黑暗各12h，雌鼠体重20～25g，雄鼠体重30～35g。

1.3卵的收集雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）（宁波第二激素厂），10IU/只，44～48h后处死，刺破卵巢表面卵泡，收集生殖泡期（GV）卵置于MEM中，或再注射hCG，5IU/只，16～18h后处死，刺破输卵管的膨大部，收集中期成熟卵（MII）。

1.4玻璃化冷冻和解冻冷冻：

室温下将卵子在PBS+20%FCS（S）中冲洗2～3次后移入10%乙二醇（EG）＋10%二甲基亚砜（DMSO）中停留30s，然后移入20%EG＋20%DMSO＋0.5mol/L糖中，用SOPS（超薄型开口拉细麦管，MINITUB，Germany）通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。

解冻：

在室温下依次将卵子移入含0.4mol/L糖、0.2mol/L糖、0.1mol/L糖的S及S中，各停留3min，再于37℃S中停留5min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟（IVM）、体外受精（IVF）或固定作免疫荧光标记。

1.5IVMGV卵置于MEM中，在CO2培养箱中培养24h后，剥除颗粒细胞，观察到排出第一极体者为MII。

1.6细胞骨架免疫荧光标记各组MII卵剥除颗粒细胞，予3%多聚甲醛固定，于0.5%TritonX-100（0694，Amresco）中室温下孵化20min，随后依次在37℃下1:

100α-微管蛋白单克隆抗体（ZM-0438，北京中杉金桥生物技术有限公司）孵化2h，1:

100FITC标记的山羊抗鼠IgG（ZF-0312，北京中杉）避光孵化1.5h，20μg/ml碘化吡啶（PI，ZLI-9038，北京中杉）避光孵化15min，最后以30%甘油装片观察。

1.7分组分四组，对照组为新鲜GV卵体外培养成熟（IVM）；GV冷冻组为GV卵剥除颗粒细胞后行玻璃化冷冻，解冻后IVM；IVM-MII冷冻组为GV卵IVM，剥除颗粒细胞后观察到第一极体者再行玻璃化冷冻；MII冷冻组为新鲜MII裸卵玻璃化冷冻。

1.8统计学处理方法采用χ2检验。

2结果2.1结果观察复苏卵子存活标准：

卵子折光性好，呈透明状，没有明显的胞浆皱缩，透明带与细胞膜都完整。

免疫荧光标记观察：

正常纺锤体为对称的桶形，且极性存在，可见清晰的丝状微管贯穿两极之间。

纺锤体极性消失，纵轴上微管减少或断裂，或纺锤体消失则均认为是异常纺锤体形态。

正常染色体紧密地排列在赤道板上，呈线性。

异常染色体则结构松散，凝结呈团或模糊不清，单根或部分染色体从赤道板中脱落[4]。

2.2结果IVM-MII组共获卵313枚，其中体外培养成熟301枚，经玻璃化冷冻解冻后获卵286枚，丢失15枚，丢失率为5%。

GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MII冷冻组三组复苏率差异无显著性（P0.05），见表1。

GV冷冻组的成熟率显著低于对照组（P0.01）。

GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MII冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P0.01），且IVM-MII冷冻组受精率显著低于MII冷冻组（P0.01）。

IVM-MII冷冻组囊胚率低于MII冷冻组及对照组，差异均有显著性（28.57%vs52.38%，P0.05；28.57%vs57.14%，P0.01），见表2。

GV冷冻组染色体、纺锤体及染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-MII冷冻组（分别为61.54%vs42.22%和61.54%vs42.22%，P0.05；53.85%vs26.67%，P0.05）。

IVM-MII冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组，且差异均有显著性（P0.05，P0.01），见表3。

3讨论生殖功能保存是目前生殖医学研究的重要方面之一，玻璃化冷冻因其诸多优点越来越受到关注。

人类精子库早已建立，并广泛应用。

而卵子库尚未建立，这是因为卵子是人体中最大的细胞，其结构复杂，来源少，冷冻难度较大。

温度敏感的纺锤体在卵子成熟、受精和卵裂过程中发挥着重要作用。

冷冻刺激易造成纺锤体微管的弥散，从而造成染色体的断裂分散，一旦受精，姐妹染色体会因无法联会，引起非整倍体胚胎[5-7]。

理论上，MII期卵子处在成熟分裂的中期，拥有独特的中期纺锤体结构且染色体规则地排列在赤道板上，冷冻更易造成其结构的损伤；而GV卵因尚未形成纺锤体结构且染色体有核膜包围保护，应比MII卵更适合冷冻保存[4]。

目前已有冻融GV卵获得成功的报道[8]，但有研究结果与理论不符。

Kuleshova等[1]报道冻融人GV卵的受精率和卵裂率（42.9%和16.7%）均远低于冻融MII卵（81%和88%）。

李梅等[2]发现冻融人成熟卵和未成熟卵复苏率相近，而前者受精率和卵裂率均高于后者。

本研究中GV冷冻组纺锤体正常率、染色体正常率及纺锤体和染色体均正常率都高于MII冷冻组（P0.05）。

MII冷冻组的受精率及囊胚率均略高于GV冷冻组，但两组相比差异无显著性（P0.05），这与Kuleshova等[1]人的研究结果相似。

目前冻融GV卵的体外成熟率与新鲜GV卵大致相当，但随后的胚胎发育潜能却远不及新鲜卵，因此有学者提出细胞浆结构在冷冻损伤中是一个更为关键的因素[9]。

因此，目前需要进一步研究如