玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响.docx

1、玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响（作者:_单位: _邮编: _） 【摘要】 目的: 通过比较玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞冷冻复苏、体外成熟、胚胎发育及细胞骨架的影响，寻求最佳的卵子冷冻方案。方法：玻璃化冷冻生殖泡期卵(GV)、成熟中期卵（M）及体外成熟卵(IVM-M），解冻复苏后，分别作体外成熟、体外受精（IVF）、胚胎培养或固定作免疫荧光标记，统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率、细胞骨架正常率。结果：GV冷冻组、M冷冻组及IVM-M冷冻组三组复苏率差异无显著性（65% vs 60.92% vs 69.93%，P0.05）。GV冷冻组

2、的成熟率显著低于对照组（79.6% vs 96.19%，P0.01）。GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-M冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P0.01），且IVM-M冷冻组受精率显著低于M冷冻组（18.06% vs 31.34%，P0.01）。IVM-M冷冻组囊胚率低于M冷冻组和对照组，差异均有显著性（28.57% vs 52.38%，P0.05；28.57% vs 57.14%，P0.01）。GV冷冻组染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-M冷冻组（53.85% vs 26.67%，P0.05）。IVM-M冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组，差异均有显著性（P0.05，P0.01）。结论

3、：GV卵先玻璃化冷冻再体外成熟，其细胞骨架损伤较小，胚胎发育较好。 【关键词】 玻璃化冷冻；卵；细胞骨架；小鼠 Abstract: Objective: To evaluate the effects of vitrification on the rates of survival，in vitro maturation (IVM)，development and cytoskeleton of mouse frozen-thawed oocytes at different stages in order to find the most suitable cryopreservation

4、 protocol. Methods: M，GV and IVM-M were vitrified. After thawed， they underwent in vitro maturation， in vitro fertilization，embryo cultivation or fixed for immunofluorescence. The rates of survival， maturation， fertilization， blastulation and cytoskeleton with normal configuration were calculated. R

5、esults: There were no significant differences of survival rates in GV，M and IVM-M group (65% vs 60.92% vs 69.93%，P0.05). The maturation rate of GV group was significantly lower than those of control group (79.6% vs 96.19%， P0.01). The fertilization rate of control group was obviously higher than GV，

6、 M and IVM-M group (P0.01)， and that of IVM-M group was significantly lower than M group （18.06% vs 31.34%， P0.01）. The blastulation rate of IVM-M was significantly lower than that of M and control groups， respectively (28.57% vs 52.38%， P0.05 and 28.57% vs 57.14%，P0.01). There were significant diff

7、erences in the rate of normal feature of spindles and chromosomes between GV group and IVM-Mgroup (53.85% vs 26.67%， respectively， P0.05). The rate of cytoskeleton indexe of IVM-Mgroup were much lower，comparing with control group (P0.05). Conclusion: There are less influences of vitrification on cyt

8、oskeleton and developmental capacity of GV ooctyes when they are vitrified before IVM. Key words: vitrification；oocyte；cytoskeleton；mouse 卵子冷冻能避免胚胎冷冻带来的伦理问题，而且增加供卵来源，并为那些因疾病需要切除卵巢或推迟生育的妇女提供生殖保险。卵子结构复杂，冷冻极易造成其不可逆的病变甚至死亡，卵母细胞成熟状态也会影响卵子冷冻结果。 成熟卵子和未成熟卵因其结构不同，对冷冻的耐受性也不同。理论上，冷冻未成熟GV卵似乎是更好的选择，但是也有报道指出GV卵对冷

9、冻更为敏感1-2。因此本研究结合胚胎学和细胞骨架指标，探讨成熟阶段对卵子冷冻结果的影响以及GV卵冷冻时机的选择。 1 材料和方法 1.1 溶液的配制 玻璃化冷冻的基础液为含20%胎牛血清（FCS）（北京中杉金桥生物技术有限公司）的磷酸盐缓冲液（PBS），体外成熟液（MEM）为含50 g/ml青霉素、75 g/ml链霉素、0.3 mol/L丙酮酸钠、200 mmol/L谷氨酰胺、20% FCS、0.075 IU/ml FSH及1 IU/ml hCG的-MEM溶液，受精液为含4 mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的KSOM液，卵裂液为含1 mg/ml BSA的KSOM液，KSOM液的配制见文献3。除

10、FCS外，其余试剂均来自美国Sigma公司。 1.2 实验动物 昆明小白鼠，控制光照和黑暗各12 h，雌鼠体重2025 g，雄鼠体重3035 g。 1.3 卵的收集 雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）（宁波第二激素厂），10 IU/只，4448 h后处死，刺破卵巢表面卵泡，收集生殖泡期（GV）卵置于MEM中，或再注射hCG，5 IU/只，1618 h后处死，刺破输卵管的膨大部，收集中期成熟卵（MII）。 1.4 玻璃化冷冻和解冻 冷冻：室温下将卵子在PBS+20% FCS(S)中冲洗23次后移入10%乙二醇（EG）10%二甲基亚砜（DMSO）中停留30 s，然后移入20% EG20%

11、DMSO0.5 mol/L糖中，用SOPS（超薄型开口拉细麦管，MINI TUB，Germany）通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。解冻：在室温下依次将卵子移入含0.4 mol/L糖、0.2 mol/L糖、0.1 mol/L糖的S及S中，各停留3 min，再于37 S中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟（IVM）、体外受精（IVF）或固定作免疫荧光标记。 1.5 IVM GV卵置于MEM中，在CO2培养箱中培养24 h后，剥除颗粒细胞，观察到排出第一极体者为MII。 1.6 细胞骨架免疫荧光标记 各组MII卵剥除颗粒细胞，予3%多聚甲醛固定，于0.5% Triton X-10

12、0(0694，Amresco)中室温下孵化20 min，随后依次在37 下1:100 -微管蛋白单克隆抗体(ZM-0438，北京中杉金桥生物技术有限公司)孵化2 h，1:100 FITC标记的山羊抗鼠IgG(ZF-0312，北京中杉)避光孵化1.5 h，20g/ml碘化吡啶（PI，ZLI-9038，北京中杉)避光孵化15 min，最后以30%甘油装片观察。 1.7 分组 分四组，对照组为新鲜GV卵体外培养成熟（IVM）；GV冷冻组为GV卵剥除颗粒细胞后行玻璃化冷冻，解冻后IVM；IVM-MII冷冻组为GV卵IVM，剥除颗粒细胞后观察到第一极体者再行玻璃化冷冻；MII冷冻组为新鲜MII裸卵玻璃化

13、冷冻。 1.8 统计学处理方法 采用2检验。 2 结果 2.1 结果观察 复苏卵子存活标准：卵子折光性好，呈透明状，没有明显的胞浆皱缩，透明带与细胞膜都完整。免疫荧光标记观察：正常纺锤体为对称的桶形，且极性存在，可见清晰的丝状微管贯穿两极之间。纺锤体极性消失，纵轴上微管减少或断裂，或纺锤体消失则均认为是异常纺锤体形态。正常染色体紧密地排列在赤道板上，呈线性。异常染色体则结构松散，凝结呈团或模糊不清，单根或部分染色体从赤道板中脱落4。 2.2 结果 IVM-MII组共获卵313枚，其中体外培养成熟301枚，经玻璃化冷冻解冻后获卵286枚，丢失15枚，丢失率为5%。 GV冷冻组、MII冷冻组及IV

14、M-MII冷冻组三组复苏率差异无显著性（P0.05），见表1。 GV冷冻组的成熟率显著低于对照组（P0.01）。GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MII冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P0.01），且IVM-MII冷冻组受精率显著低于MII冷冻组（P0.01）。IVM-MII冷冻组囊胚率低于MII冷冻组及对照组，差异均有显著性（28.57% vs 52.38%，P0.05；28.57% vs 57.14%，P0.01），见表2。 GV冷冻组染色体、纺锤体及染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-MII冷冻组（分别为61.54% vs 42.22%和61.54% vs 42.22%，P0.05；5

15、3.85% vs 26.67%，P0.05）。IVM-MII冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组，且差异均有显著性（P0.05，P0.01），见表3。 3 讨论 生殖功能保存是目前生殖医学研究的重要方面之一，玻璃化冷冻因其诸多优点越来越受到关注。人类精子库早已建立，并广泛应用。而卵子库尚未建立，这是因为卵子是人体中最大的细胞，其结构复杂，来源少，冷冻难度较大。温度敏感的纺锤体在卵子成熟、受精和卵裂过程中发挥着重要作用。冷冻刺激易造成纺锤体微管的弥散，从而造成染色体的断裂分散，一旦受精，姐妹染色体会因无法联会，引起非整倍体胚胎5-7。理论上，MII期卵子处在成熟分裂的中期，拥有独特的中期纺锤体

16、结构且染色体规则地排列在赤道板上，冷冻更易造成其结构的损伤；而GV卵因尚未形成纺锤体结构且染色体有核膜包围保护，应比MII卵更适合冷冻保存4。 目前已有冻融GV卵获得成功的报道8，但有研究结果与理论不符。Kuleshova等1报道冻融人GV卵的受精率和卵裂率（42.9%和16.7%）均远低于冻融MII卵（81%和88%）。李梅等2发现冻融人成熟卵和未成熟卵复苏率相近，而前者受精率和卵裂率均高于后者。本研究中GV冷冻组纺锤体正常率、染色体正常率及纺锤体和染色体均正常率都高于MII冷冻组（P0.05）。MII冷冻组的受精率及囊胚率均略高于GV冷冻组，但两组相比差异无显著性（P0.05），这与Kuleshova等1人的研究结果相似。目前冻融GV卵的体外成熟率与新鲜GV卵大致相当，但随后的胚胎发育潜能却远不及新鲜卵，因此有学者提出细胞浆结构在冷冻损伤中是一个更为关键的因素9。因此，目前需要进一步研究如