各种酶活性测定方法.docx
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各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法
第一超氧化物歧化酶SOD测定
一、原理
超氧物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O
2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O
2,从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料;水稻或小麦叶片
(二)仪器设备:
1.高速台式离心机;2.分光光度计;3.微量进样器;4.荧光灯(反应试管处照度为4000Lx);5.试管或指形管数支。
(三)试剂1.0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8);2.130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:
称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml;3.750μmol/L氮蓝四唑溶液:
称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存;4.100μmol/LEDTA-Na
2溶液:
称取0.03721gEDTA-Na
2用磷酸缓冲液定容至1000ml;5.20μmol/L核黄素溶液:
称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。
三、实验步骤
1.酶液提取取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5~2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液。
2.显色反应取5ml指形管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液:
试剂(酶)用量(ml)终浓度(比色时)0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750μmol/LNBT溶液0.375μmol/L100μmol/LEDTA-Na
2液
0.310μmol/L20μmol/L核黄素0.320μmol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水
0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min(要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长)。
3.SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度。
四、结果计算
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性。
SOD总活性=(A
ck-A
E)×V/(A
ck×0.5×W×V
t)
上式中,SOD比活力=SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示;比活力单位以酶单位/mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积(ml)Vt测定时样品用量(ml)W样鲜重(g)蛋白质含量单位为:
mg蛋白/g鲜重。
SO
D、PO
D、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法
缩写:
SOD:
超氧化物歧化酶;CAT:
过氧化氢酶;POD:
过氧化物酶;MDA:
丙二醛;PVP:
聚乙烯吡咯烷铜K-30;L-Met:
甲硫氨酸;
NBT:
氮蓝四唑;TBA:
硫代巴比妥酸;TCA:
三氯乙酸;PBS:
磷酸缓冲液
1.SOD的测定方法
加样顺序:
(V=3ml)磷酸缓冲液:
1.5mlL-Met:
0.3mlNBT:
0.3ml
EDTA-Na2:
0.3ml核黄素:
0.3ml酶液:
0.05ml蒸馏水:
0.25ml
试剂配制:
(1)0.05mol/LPBS:
pH7.8
(2)130mmol/LL-Met:
1.9399gMet用PBS定容至100ml
(3)750mmol/LNBT:
0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)
(4)100umol/LEDTA-Na2:
0.03721g用PBS定容至1000ml
(5)20umol/L核黄素:
0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存)
注:
(1)对照:
以加缓冲液、不照光为空白;照光的为最大还原管
(2)照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值
2.MDA的测定方法
试剂配制:
(1)5%TCA:
5g用蒸馏水定容至500ml
(2)0.5%TBA:
2.5g用TCA定容至500ml
方法:
酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却,100r/min离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值
3.POD的测定方法
试剂配制:
(1)0.1mol/L的醋酸缓冲液:
8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液
A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中
B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—13.6gNaAc.3H2O
(2)0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml50%乙醇中(临用前配制)
(3)0.75%H2O2溶液:
1.25ml30%H2O2定容至50ml(临用前配制)
方法:
比色杯中依次加入2ml0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml0.25%愈创木酚溶液—xml酶液(5min值为500-800即可)—0.1ml0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min
4.CAT的测定方法
试剂配制:
(1)50mmol/L的PBS(pH7.0)
(2)0.3%H2O2—1mlH2O2定容至100ml
方法:
(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS(pH7.0)为空白把A240调零
(2)50ul酶液—3ml50mmol/L的PBS(pH7.0)—0.2ml0.3%H2O2—迅速颠倒混匀,开始计时—1min后在240nm下比色,1次/1min(连续读取5min)。
2010年06月22日星期二19:
33
1xx含量测定:
80%的丙酮液的配制:
4L丙酮+1L蒸馏水。
称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管(做三个重复),加入25ml浓度为80%的丙酮液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度,以80%的丙酮液为空白。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35~36)
也可用95%乙醇溶液,在
665、649、470nm处有最大吸收峰
Ca=13.95D665-6.8649
Cb=24.96D649-7.32D665
Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245
2抗氧化酶活性的定:
(2.5g样)
0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)(pH=7.8)溶液的配制:
65.5506gNa2HPO4·12H2O+2.65285gNaH2PO4·2H2O,定容到4L。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P134)。
取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片(或根)放在50ml的离心管,加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液(pH=7.8)(最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活),研磨(用磨碎机磨),8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液。
2.1丙二醛(MDA)的测定:
20%三氯乙酸(TCA)溶液的配制:
称200g三氯乙酸,用蒸馏水定容到1000ml。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124);
0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液的配制:
称5g硫代巴比妥酸(TBA),用20%三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定容到1000ml。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124)(先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解);
0.5ml酶液(对照用0.5ml的0.05mol/LpH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液)(做三个重复)+3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却(至少30min)――比色(O
D600、O
D532、OD450)。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124)
2.2超氧化物歧化酶(SOD)的测定:
NBT(400ml)混合反应液:
392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206gNBT+0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4mlEDTA-Na溶液(100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素)。
(另配)100mlPBS溶液加EDTA-Na3.7224gEDTA-Na
测试时:
取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02ml(叶)粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度。
2.3过氧化物酶(POD)的测定:
0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)(pH=7.0)溶液的配制:
10.9251gNa2HPO4·12H2O+3.042975gNaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。
0.3%H2O2溶液的配制:
吸2.5ml30%H2O2,用0.05mol/LpH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
0.2%愈创木酚溶液的配制:
称0.5g愈创木酚,用0.05mol/LpH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
2ml0.3%H2O2溶液+0.95ml0.2%愈创木酚溶液+1ml0.05mol/LpH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)+0.02ml?
?
(原来为0.01)酶液(根加0.05ml酶液)(对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液)(做三个重复),记录470nm处OD降低速度。
将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121)
比色时加酶液,混合后即刻计时。
2.4脯氨酸的测定
标准曲线的制作:
编号标准脯氨酸的量(ml)0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
H2O(ml)
1.0
0.9
0.8
0.6
0.4
0.20冰乙酸(ml)显色液(ml)脯氨酸含量(µl)012468
10
0.5ml酶液(对照用0.5ml80%乙醇代替)(做三个重复)+1ml冰乙酸+1.5ml显色液―――混匀,沸水浴15min,冷却后测OD520。
2.5可溶性蛋白的测定(参考赵志杰,史国安,董新纯编的《植物生理学实验指导》)牛血清白蛋白:
配成100µg/ml和1000µg/ml。
90%乙醇:
90ml乙醇+10ml蒸馏水。
?
?
?
85%(W/V)磷酸:
170ml磷酸+30ml蒸馏水。
考马斯亮蓝G-250:
称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸200ml,用蒸馏水定容到2L。
常温下可保存一个月。
标准曲线的制作:
配制0~100µg/ml血清白蛋白血液
管号123456
100µg/ml牛血清白蛋白(ml)0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水量(ml)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.20蛋白质含量(ml)0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
配制0~1000µg/ml血清白蛋白血液
管号78910
11
12
100µg/ml牛血清白蛋白(ml)0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水量(ml)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.20蛋白质含量(ml)0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.1ml酶液(做三个重复)+5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀,放置2min后在595nm下比色。
2.6过氧化氢酶(CAT)的测定:
0.3%H2O2溶液的配制:
吸5ml30%H2O2,用0.05mol/LpH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到500ml。
1ml0.3%H2O2溶液+1.9mlH2O+0.1ml酶液,测定240nm处OD降低速度。
将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121)
2.7抗坏血酸(ASA)的测定:
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125)5%三氯乙酸(TCA)溶液的配制:
25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到500ml。
10%三氯乙酸(TCA)溶液的配制:
25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到250ml。
150mmol/LNaH2PO4(pH7.4)溶液的配制:
100ml。
44%H3PO4溶液的配制:
250ml。
4%2,2-二联吡啶溶液的配制:
250ml。
3%FeCl3溶液的配制:
100ml。
首先标制作准曲线。
粗酶液的提取:
取低温保存的鲜样,称0.5g左右的叶片(或根)放在50ml的离心管,加入15m5%三氯乙酸(TCA)溶液(最好是较冷的三氯乙酸(TCA)溶液,防止研磨时温度过高使酶失活),研磨(用磨碎机磨),15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟,上清液为粗酶液,用于抗坏血酸(ASA)含量的测定。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125~126)
测定:
0.2ml粗酶液+0.2ml150mmol/LNaH2PO4(pH7.4)溶液+0.2mlH2O,混匀(振荡),至少30秒后,再依次分别加入:
0.4ml10%三氯乙酸(TCA)溶液+0.4ml44%H3PO4溶液+0.4ml4%2,2-二联吡啶溶液+0.2ml3%FeCl3溶液,混合后在37℃水浴中保温60min,测定OD525处的值。
(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125~126)
2.8谷胱甘肽的测定:
4g新鲜材料+2ml0.3mol/L醋酸汞+2ml30%醋酸钠后研磨匀浆,转移到离心管中,以蒸馏水冲洗残渣,并以玻璃棒搅拌,净置10min,使之充分沉淀,离心后弃去上清液,沉淀以水(每次10ml)在摇动情况下冲洗2次。
向沉淀中加入10ml1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽,以玻璃棒搅拌5min后加入1ml20%的碘化钾溶液,混匀,离心。
上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中,沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗。
离心后溶液与第一次离心液合并。
向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液,用1mmol/LKIO3滴定,直至出现不消失的蓝色为止。
1ml1mmol/L的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽。
(参考《现代植物生理学实验指南》,中国科学院上海植物生理研究所编)。
2.9天冬酰胺合成酶(AS)的测定:
2.10天冬酰胺转氨酶(AspAT)的测定:
3硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法:
(1g样)(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27~29)
亚硝酸钠标准溶液(1µg/ml):
称NaNO20.9857g,定容到1000ml,再吸5ml定容到1000ml。
0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲溶液:
30.0905gNa2HPO4·12H2O+2.4965gNaH2PO4·2H2O,加蒸馏水定容到1000ml。
3mol/LHCl:
125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。
1%磺胺溶液:
5.0g磺胺溶于500ml3mol/LHCl中。
0.2%a-萘胺溶液:
1.0ga-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml,贮于棕色瓶中。
0.1mol/LKNO3溶液:
5.055gKNO3溶于500mln0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲溶液。
0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲溶液:
Na2HPO4·12H2O8.8640g+NaH2PO4·2H2O0.0570g,加蒸馏水定容到1L。
提取缓冲液:
1.211g半胱氨酸+0.372gEDTA,溶于1L0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲溶液。
2mg/mlNADH溶液:
0.5gNADH溶于250ml0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲溶液(临用前配制)。
首先标制作准曲线:
取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,即配成0~2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。
摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色。
以亚硝态氮(μg)为横坐标(x),光密度值为纵坐标(y)绘标准曲线或建立回归方程。
各试剂加入顺序
管号亚硝酸钠标准液(ml)0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水(ml)
2.0
1.8
1.6
1.2
0.8
0.401%磺胺溶液(ml)
0.2%α-萘胺(ml)每管含NO2-(μg)0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
1g材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆,转移到离心管中于4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液,用于硝酸还原酶(NR)的测定。
0.4ml+1.2ml0.1mol/LKNO3溶液+0.4mlNADH溶液后混匀(对照不加NADH溶液,而以
0.4ml0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液代替),在25℃水浴中保温30min。
保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应,再加1ml0.2%a-萘胺溶液,显色反应15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度。
根据回归方程计算。