复明片对兔视网膜离开后视网膜色素上皮细胞增殖的阻碍.docx

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复明片对兔视网膜离开后视网膜色素上皮细胞增殖的阻碍

复明片对兔视网膜离开后视网膜色素上皮细胞增殖的阻碍

刘娉，彭清华，李建超，彭抿，吴大力，张波涛，杨霞

【摘要】目的研究复明片对兔实验性视网膜离开后视网膜色素上皮细胞（retinalpigmentepithelium,RPE）增殖的阻碍。

方式用有色家兔96只设正常对照组（A组），制作视网膜离开模型后分模型组（B组）、西药对照组（C组）、复明片组（D组）。

并于造模后7、14、21d别离取视网膜组织制备细胞悬液，流式细胞仪检测各兔增殖细胞核抗原（PCNA）在视网膜神经上皮层的表达。

结果离开后视网膜神经上皮层PCNA阳性细胞表达均呈上升趋势，7d后开始下降，且复明片组相较其余各组比较均有统计学意义（P<）。

结论复明片通过恢复视网膜色素上皮与神经上皮之间的接触，阻止RPE的增殖即PCNA的表达。

【关键词】复明片；视网膜色素上皮细胞；增殖细胞核抗原；流式细胞仪；兔；黄芪；生地；茯苓

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕ＯｂｊｅｃｔｉｖｅTostudytheeffectofFumingtabletonproliferationofretinalpigmentepithelium（RPE）inrabbits'eyeswithretinaldetachment（RD）.Method96healthyadultcolouredrabbitswererandomlydividedintofourgroups:

blankgroup（groupA）,modelcomparativegroup（groupB）,westernmedicinetreatinggroup（groupC）andFumingtablettreatinggroup（groupD）.Thecellsuspensionswerepreparedwithretinaltissuesgainedat7th,14thand21thdayaftermodeling,andtheexpressionofproliferatingcellnuclearantigen（PCNA）inretinalneurosensorylayerwasexaminedbyflowcytometry（FCM）.ResultTheexpressionofPCNAincreasedinthefourgroupsafterdetachment,whileitbegantodecreaseafter7thday,andtheexpressioningroupDwassignificantthanthatinothergroups（P<.ConclusionFumingTabletcaninhibittheexpressionofPCNAbythecontactofbothretinalneurosensorylayerandretinalpigmentepitheliumlayerwasrecoveredbysowasprevented.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕Fumingtablet;retinalpigmentepithelium;proliferatingcellnuclearantigen;flowcytometry;rabbits;Radixastragali;Rhizomeofrehmannia;Poriacocos

视网膜离开（retinaldetachment,RD）是指视网膜色素上皮与神经上皮之间的分离，是严峻的致盲眼病，可致使眼球萎缩。

在众多致盲因素中占第5位，14岁以下儿童占第4位[1]。

视网膜离开手术后的解剖复位率达95％以上，但术后视功能恢复仍不睬想。

目前，尚缺乏能应用于临床的有针对性的药物。

寻求能改善视网膜离开手术后增进患者视功能的辅助医治，是临床上亟待解决的问题。

1材料与方式

材料

动物成年健康有色家兔96只，体质量～kg，雌雄各半，由湖南中医药大学实验动物中心提供。

动物合格证号：

医动字第20-003号。

药品复明片：

由黄芪、生地、茯苓、车前子、地龙、赤芍、红花、白术等中草药按现代制剂制备工艺制成，g/片，选用同一批号药物，批号：

040208。

由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。

利历时去掉糖衣，研成粉末，温开水混合，配制成浓度为10%的混悬液；三磷酸腺苷二钠片（AdenosineDisodiumTriphosphateTablets,ATP）：

20mg/片，福建古田药业生产，批号：

050827-1；维生素B1（VitaminB1，VitB1）：

10mg/片，湖北华中药业生产，批号：

；维脑路通：

60mg/片，山西晋新药业集团生产，批号：

050811，利历时研成粉末，温开水混合，配制成每升水含VitB11276mg、ATP1102mg、维脑路通734mg的溶液；透明质酸酶：

上海第一生化药研所生产，批号：

。

仪器OPTON多功能显微镜（德国OPTON公司生产）；Olympus光学显微镜（日本OLYMPUS公司生产）；双目间接眼底镜（美国WelchAllyn公司生产）；Topcon眼科手术显微镜（日本TOPCON公司生产）；眼底接触镜（苏州医疗器械生产）；eppend-orf5804R/5810R型高速冷冻离心机（德国SIGMA公司生产）；Beckmancoulter流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司生产）。

试剂PCNA测试盒（武汉博士德生物工程生产）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程生产）。

方式

兔眼视网膜离开模型成立依照文献[2]等提出的方式，并加以改良。

术前3d用％氯霉素眼药水和1％阿托品眼药水交替滴眼，3次/d。

手术当日生理盐水冲洗结膜囊，术前滴1％丁卡因眼药水2~3次。

造模时术眼（均取右眼）采纳10%新福林和1%阿托品散瞳。

3%戊巴比妥耳缘静脉注射（1mL/kg）麻醉后，将兔固定于手术台上，庆大霉素加生理盐水混合液冲洗结膜囊，常规消毒铺巾、开睑。

点丁卡因表面麻醉，方筋膜下注入2％利多卡因mL形成泡状隆起，沿角膜缘环行剪开鼻侧球结膜和筋膜，向后稍分离，暴露赤道部巩膜，距角巩缘后5mm睫状体平坦部用25GB-D针头垂直眼球壁刺穿巩膜，在眼底接触镜和显微镜直视下观看到伸入玻璃体内的针尖，将10IU/mL透明质酸酶溶液mL缓慢注入到玻璃体的中央偏后部，拔针后压迫注射点3min。

15min后再由原穿刺口将自制视网膜下腔注射针头缓慢探进，反复抽吸mL液化的玻璃体，在眼底接触镜和显微镜直视观看下警惕地把针尖引向后极部，躲开视网膜血管，在颞侧距视乳头1个视盘直径（PapillaDisc,PD）放射状视网膜处刺穿视网膜，进入视网膜下腔，助手缓慢推动注射器，注入液化的玻璃体液mL，可见视网膜被分离，离开的视网膜呈大片灰白色隆起，范围约1/2个PD大小，退出针头，角膜缘处放出房水以降低眼内压。

术后摊平球结膜，结膜囊涂%四环素眼膏，结膜下注射庆大霉素加地塞米松mL，肌肉注射庆大霉素万u，以防感染，术后1周天天用氯霉素眼药水点眼4次，并一直给1%阿托品眼液散瞳。

给药方式造模后第1天下午开始给药，A组（正常对照组）与B组（模型对照组）均予温开水灌胃，5mL/kg，每日1次；C组（西药对照组）予西药混合溶液灌胃，5mL/kg，每日1次；D组（复明片医治组）予复明片混悬液灌胃，5mL/kg，每日1次。

标本制备、细胞悬液制备方式及流式细胞检测于造模后7、14、21d，各兔用3%戊巴比妥耳缘静脉注射（1mL/kg）麻醉，摘除眼球，生理盐水冲洗干净。

在冰生理盐水中，沿角巩缘剪开眼球达360度，弃角膜、晶体、玻璃体，保留视网膜连同脉络膜巩膜组织，掏出视网膜于定量滤纸上加少量PBS（pH~液，用显微剪均匀剪碎，制备细胞悬液，75%乙醇固定，4℃冰箱保留备用。

收齐样本后取细胞悬液1000r/min离心7min，弃上清后加入75%乙醇混匀固定。

测试当日加含10%的胎牛血清1mL室温下放置20min后磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗2次，每次3min，1000r/min离心7min，弃上清。

阳性组加入PCNA1∶50配比50μL每管，阴性对照组加PBS液50μL每管，4℃留宿。

PBS洗3次，每次5min，1000r/min离心7min，弃上清。

1∶200异硫氰酸荧光素（FluoresceinIsothiocyanate，FITC）标记二抗，室温孵育2h，MPBS洗3次，每次5min，1000r/min离心7min，弃上清。

加入PBS800μL，应用FACSCalibur型（BectonDickinson公司）流式细胞仪检测PCNA阳性细胞百分数。

每次检测都设有空白对照及正常对照，每时刻点检测3~5次，取平均值。

统计方式

用统计软件包进行统计学处置，所有实验数据以均数标准差（ｘ±ｓ）表示。

2结果

离开后视网膜神经上皮层PCNA阳性细胞表达均呈上升趋势，7d后开始下降。

7d时模型组、西药对照组、复明片组、正常对照组各组间不同均有统计学意义；14d时除复明片组与西药对照组其余各组比较不同均有统计学意义；21d时除复明片组与正常对照组及复明片组与模型组外，其余各组比较不同均无统计学意义。

见表1。

3讨论

中医对视网膜离开的熟悉及医治

在祖国医学文献中无“视网膜离开”病名，依照其临床表现，可归属于“暴盲”、“神光自现”等范围，为“外不见证，从内而蔽”的内障眼病。

中医文献上的某些记载，与本病很是相似，如《证治准绳·七窍门》中：

“谓目外自神光显现，每如电光闪掣，甚那么如火焰霞明，时发时止，……乃神光欲散，内障之重者”；《抄本眼科》“落气眼”一症：

“突然眼目黑暗，不能视见，白日如夜，此症乃元气下陷，阴气上升”；《目经大成》也有“电光夜照”病症的记载。

传统中医学以为,视衣（视网膜）为瞳神深部组织,RD属内障眼病,属于瞳神疾病范围；瞳神称水轮,在脏属肾,视网膜是大脑的延伸部份,肾生髓于脑,故视网膜的病变与肾紧密相关。

肝胆互为内外,肝肾同源,肾藏精而肝藏血,目得精血之养才能视觉灵敏,故肝肾不足,精血亏虚,常为视网膜病的重要病因病机;又肝主疏泄,肝郁那么气滞,气滞那么血瘀,视网膜病变亦常与此有关;脾为后天之本,气血生化之源,主运化水湿,脾虚气血不足,目失所养或水湿上泛是视网膜发生变性、水肿、渗出或增殖的重要病机。

故视网膜、玻璃体的病变与肝、胆、肾、脾等脏腑功能紧密相关[3]。

视网膜离开产生之缘故，多为患者气虚不固致视网膜不能紧贴球壁而脱落；而视网膜离开手术是一种人为的眼外伤，术后多有瘀血病理存在，有时术中还可致视网膜出血；本病术中不管放水与不放水，其术后多有网膜下积液存留；而术中不可幸免之出血又可使眼部阴血亏虚。

中医眼科从来重视围手术期的药物医治，尤注重手术后用药。

在RD的医治上，目前一样主张中西结合，在RD围手术期应用中医中药，如术前应用补肺生津兼以利水方，术后应用滋养肝肾、益气养阴兼以活血化瘀方[3]；或服用具有调理补益、活血化瘀渗湿功用的中药；或配合散结通络，活血明目中药RD2号方口服；或采纳和营清热、温阳利水法中药医治；或应用中药RD1号方（利水方剂）联合皮质内固醇医治，或针刺疗法改善实验性RD视网膜组织中PKC的活性、及提高兔眼环扎术后房水氧含量，均能够增进术眼的恢复，防治手术并发症[4]。

活血利水之复明片对RPE细胞PCNA表达的阻碍

最近几年研究结果提示，网脱后视细胞外节变性、视细胞凋亡及不完全再生是术后视力恢复不良的要紧缘故。

视网膜色素上皮与神经上皮之间的分离,致使RPE细胞的直接暴露，RPE细胞在各类细胞因子、生长因子等的作用下开始增殖，同时Müller细胞亦启动增殖，RPE细胞及Müller细胞的增生、肥大不仅填充了视网膜中死亡的光感受器细胞留下的空缺，Müller在视网膜内层中的数量和大小也增加，这些细胞有在视网膜下空间生长并形成庞大瘢痕的偏向性，从而完全阻碍了外节的再生[5]，阻碍视功能的恢复，并增进PVR的形成。

赵明威等[6]研究发觉RPE细胞对FN的吞噬受细胞内PKC、TK和PI32K信号传导通路的调剂，增殖的RPE细胞吞噬功能下降，阻碍其对感光细胞的代谢作用，也即阻碍视功能的恢复。

那么是一种细胞DNA合成和细胞周期进程中的必要蛋白,它最先表达在G1期,峰值在S期,以后在G2期和M期呈弱表达[7]。

Grierson等[8]以为在正常RPE细胞层，大多数细胞间彼此紧密接触具有协同作用,处于“接触抑制”状态。

当局部产生损伤时,与损伤区毗邻的细胞彼此孤立,细胞间的协同作用丢失,而且与来自周围损伤组织的信号发生反映。

细胞运动和增殖的接触抑制被打破,以致于最终进入细胞周期开始增殖。

当视网膜复位后，RPE细胞恢恢复有的协同作用，重建细胞间的平稳，接触抑制恢复，RPE细胞的增殖慢慢停止。

还有研究以为各类生长因子及其受体、细胞外基质（ECM）及其整合素受体和基质金属蛋白酶及其抑制物等彼此作用维持细胞生长的平稳调控的[9]。

在正常情形下,某些特殊的ECM对RPE细胞的增殖存在负调控作用[10]，从而抑制了RPE细胞增殖。

本实验结果显示,空白组PCNA表达很低,模型组PCNA表达明显增高,其余各组眼内的含量也明显高于空白组,而活血利水医治组PCNA表达明显较模型组低,亦低于西药对照组,说明活血利水法医治（用复明片）在抑制PVR进展进程中起作用。

复明片以益气养阴、活血利水为原那么，用补阳还五汤为主益气活血，加茯苓、车前子、泽泻益气利水消肿；生地、女贞子、旱莲草补养阴血。

前期临床研究显示用于医治网脱术后视力消退患者，对提高视力有较好的成效（有效率为%），且经追踪观看，其疗效巩固[11]。

方当选用黄芪大补脾胃之元气，令气旺血行，瘀去络通；地龙、赤芍、红花活血祛瘀通络；白术健脾益气、利水；车前子、茯苓配伍生地使其利水而不伤阴。

本方补气药与活血药相配，使气旺那么血行，共奏益气活血利水而不伤正之功。

现代药理学研究说明两类药合用具有抗炎、增进免疫功能、延缓衰老、减少自由基的生成并增进其清除，及抑制血小板钙调蛋白而使磷酸二酯酶的活性下降，使血小板内cAMP含量增加而明显抑制血小板的聚集，扩张血管，抗血凝，从而增进视网膜血液循环，改善能量代谢，增强组织的抗氧化能力，减轻自由基对组织的损伤，还具有和醛固酮及其拮抗剂相似的结构而具有利尿、抗癌等作用。

合方利水药增进视网膜下液吸收，益气、活血、养阴可恢复正气都可使视网膜色素上皮与神经上皮之间恢复接触，从而阻止RPE的增殖即PCNA的表达。

【参考文献】

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