DAPI.docx

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DAPI

DAPI

CAS#：

28718-90-3

中文名：

4＇,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐

英文名：

4＇,6-Diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride

结构式：

分子式：

C16H17Cl2N5

分子量：

350.25

性质：

1.外观：

黄色粉末

2.纯度：

≥95%（HPLC）

3.产品描述：

DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。

和双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光。

和EB（ethidiumbromide）相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。

DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。

因为DAPI是含有特定AT序列DNA的一种嵌入剂，它能像Hoechst染料一样粘附在DNA双螺旋的小沟区。

尽管DAPI不能通过活细胞膜，但却能穿透扰乱的细胞膜而对核染色。

DAPI具有很高的光漂白承受水平，能用来检测酵母线粒体DNA，叶绿体DNA，病毒DNA，microplasmDNA以及染色体DNA。

DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360nm和460nm。

4.染色过程

（1）用1mLddH2O将DAPI溶解，制得2.9mM的DAPI溶液（1mgDAPI/1mLH2O）。

注：

DAPI不能直接用PBS等缓冲溶液溶解，需要先用水将其溶解。

（2）取适量DAPI水溶液加到PBS中，制备成10~50µM的DAPI溶液。

推荐以下PBS的配制方法：

将8.00gNaCl、0.20gKCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2gKH2PO4溶解于1L纯水中。

（3）将1/10培养基体积的DAPI溶液加入到细胞培养基中。

也可以用1/10浓度的DAPI缓冲液代替培养基。

（4）在37℃培养细胞10~20分钟。

（5）用PBS或合适的缓冲液洗细胞两次。

（6）用带有360nm激发波长，460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。

储存条件：

-20℃，避光保存

注意事项：

DAPI对人体有一定刺激性，请注意适当防护。

荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。

为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。

DAPI保存：

放在4℃保存。

DAPI配制：

使用无菌三蒸水溶解，可以将10mgDAPI溶解在10ml水中，使用冻存管分装，每一管1ml，－20℃冻存。

使用的时候，先取一管放在4℃。

染色：

把培养皿中的培养基换一次液，每一个皿中放4－8ml培养基，使用微量加样器加DAPI到培养皿中。

浓度50ug/ml,也就是4ml培养基对0.2mlDAPI工作液，注意避光，无菌操作。

移植前使用PBS洗6遍，使用DMEM混悬，每一皿细胞混悬在1mlDMEM中，放在1ml管中，备用。

染色可以2小时，或者移植前一天染色，都可以的。

以前整理的dapi染色相关资料，在dxy搜索。

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1.用1mlddH2O将DAPI溶解，制得2.9mM的DAPI溶液（1mgDAPI/1mlH2O）。

*

*DAPI不能直接用PBS等缓冲液溶解，需要先用水将其溶解。

2.取适量DAPI水溶液加到PBS*中，制备成10-50µM的DAPI溶液。

a）

*推荐以下PBS的配制方法：

NaCl:

8.00gKCl:

0.20gNa2HPO4.12H2O:

2.9gKH2PO4:

0.2g

以上试剂溶解于1000ml纯水中

3.将1/10培养基体积的DAPI溶液加入到细胞培养基中。

b）

4.在37℃培养细胞10-20分钟。

5.用PBS或合适的缓冲液洗细胞两次。

6.用带有360nm激发波长，460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。

a）由于DAPI可能具有致癌性，请小心操作。

b）也可以用1/10浓度的DAPI缓冲液代替培养基。

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CM-Dil和DAPI的,因为者两种都是荧光染料,只不过CM-Dil是标记细胞膜的,而DAPI是标记细胞核的,但大家都认为用DAPI标记细胞,细胞死亡后DAPI会释放出来将周围为标记的细胞染上DAPI,那么CM-Dil是否也存在这样的问题呢?

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比较认可的活细胞标记方法可采用PKH26染色，荧光可在体内存留一个月，并可进行核等的复染。

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但是DAPI染色进行的干细胞示踪的文章有些杂志主编不承认，主要是因为细胞破裂后释放出的DAPI会使周围的细胞都染色，尤其是血管内皮细胞。

我看到的文献说DAPI标记细胞以后，在体内是不会再使周围的细胞染色。

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我也是用DAPI标记骨髓间充质干细胞，DAPI的激发光波长为358nm,发射光波长为461nm,荧光激发下发蓝光，与细胞核DNA结合，染核。

它不会影响细胞生长、分裂、分化，并且可以通过细胞的有丝分裂使子代细胞核染色。

染色后，通过换液，可以除去培养基中残留的染色剂，避免非染色目的细胞染色，出现假阴性结果。

细胞经过DAPI染色后，不会出现染色剂脱落而使相邻细胞染色，所以不会影响其在实验中的示踪作用。

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我的同学做过，做大鼠的心脏可以在一个月以后检测到。

我的另一个朋友做兔子的膀胱肿瘤，他说在14天的时候很强，21天的时候比较弱，再长的时间就没有检测过。

我自己现在还没有对移植后的细胞检测。

文献上说50天以后还可以看到DAPI的标记。

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前一段时间做干细胞的DAPI染色，把自己收集的一些相关资料和自己的经验写在这里，希望能够给做DAPI染色的战友一点帮助。

将培养中的细胞进行DAPI染色，标记细胞核。

DAPI保存：

放在4℃保存。

DAPI配制：

使用无菌三蒸水溶解，可以将10mgDAPI溶解在10ml水中，使用冻存管分装，每一管1ml，－20℃冻存。

使用的时候，先取一管放在4℃。

染色：

把培养皿中的培养基换一次液，每一个皿中放4－8ml培养基，使用微量加样器加DAPI到培养皿中。

浓度50ug/ml,也就是4ml培养基对0.2mlDAPI工作液，注意避光，无菌操作。

移植前使用PBS洗6遍，使用DMEM混悬，每一皿细胞混悬在1mlDMEM中，放在1ml管中，备用。

染色可以2小时，或者移植前一天染色，都可以的。

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DAPI除与DNA双链结合外，还可与细胞浆中的微管蛋白结合，故胞浆也

着蓝色。

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一般用PBS缓冲液漂洗至少6次以洗掉未结合的DAPI,建议多洗几次

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DAPI可以用PBS\培养基来配制，这样可以在细胞培养时，直接进行染色。

但工作浓度一般较低的，约1～5μg/mL

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DAPI标记的原理，应用以及优缺点

一、DAPI的特性

DAPI荧光染料是由Dann等人于1971年合成的，共化学名称为4',6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride（DAPI）的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，其结构式为

是一种常用的荧光染料，分子量为350．3．这种二价阳离于的荧光染料是一种黄色晶体易镕于水，最大溶解度为2．5％．可按高浓度的两价或高价阴离于（硫酸盐离子和磷酸盐离子）所沉淀，其作用机理与溴化乙锭等染色剂的机理类似：

DAPI具有与各种来源的、富古A—T碱基对的DNA专一结合的特点．DAPI与DNA形成的复合物发出志强度的浅蓝色荧光．共最大的激发波长为372nm，最大的发射波长为454nm，其荧光可按适当浓度的SO42－加强．DAPI最初是作为一种杀锥虫剂合成的，以后用于DNA的检测．Brunk等和Coleman等人证明了DAPI荧光强度与细胞内的DNA含量呈正比，并指出，在pH4—8范围内，DAPI－DNA复合物的荧光强度不受pH变化的影响．用DAPI染色法可以测出2x10－16gDNA。

近年来，DAPI多用于细胞生物学和细胞遗传学的研究，由于死、活细胞的细胞膜对DAPI的通透性不同，极低浓度（0.5ug／ml）的DAPI就可与死亡细胞的DNA结合，产生明亮而稳定的荧光，所以人们开始把这一理想的话体荧光染科用于微生物、植物和动物细胞的细胞生物学和生物化学的研究。

作为一种新型的DNA荧光染科，它具有专一性强、灵敏度高、稳定性好等特点，而且迄今尚来见到DAPI致癌。

致畸等毒性报告．有文献称之为无毒性荧光染料（Renard，1982）．

利用DAPI能与细胞DNA稳定结合这一特性，最近被人们用于干细胞的体内示踪。

如造血干细胞和间充质干细胞的体内移植。

Ssx

DAPI是一种标记细胞核的荧光染料，因其与dsDNA有高度的亲和力，与DNA结合后会发出强烈的荧光。

DAPI对活细胞无毒性，不改变细胞器的超微结构，荧光保持时间较长。

文献显示DAPI标记的肌卫星细胞移植到宿主心肌2月后仍然可以看到。

但DAPI在电镜下没有显示，若进行超微结构追踪观察需结合其它特殊的抗体标记。

二、方法

Cells主任介绍了利用DAPI染色标记细胞核的方法：

实验用具及材料

试剂：

PBS,胎牛血清（FBS）,固定液,DAPI染色液,DMEM培养基,胰酶（Trypsin）

器材：

培养皿,15ml离心管,试剂瓶,微量移液器,脱色摇床,锡箔,荧光显微镜和CCD

溶液配制

（1）固定液：

将4g多聚甲醛加入80mlPBS中，搅拌过夜或者搅拌过程中微热直至固体全部溶解，定容至100ml就成为4％的多聚甲醛固定液。

（2）DAPI染色液：

在500ml水中加入8.5gNaCl和1.2gTris碱，用盐酸调pH值至7.4，再加入4ml500mM的CaCl2和44ml500mM的MgCl2以及0.05g的BSA；最后加入10mg的DAPI和100ml的DMSO，定容至1L，4度保存。

实验步骤

（1）转染两天后的细胞吸取培养基后，PBS洗一次。

（2）用4%的多聚甲醛P