分子生物学期末复习.docx

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分子生物学期末复习

分子生物学期末复习

1.基础BasicKnowledge

a）中心法则

b）

真核生物基因结构

5’-cap:

7-甲基Gcap---5’-5’3pbond---5’-end

c）原核生物基因结构

d）gene复制化学：

i.复制原料：

✧dNTPs,

✧Primer（3’-OH）

✧Template,

ii.（DNAdependent）RNApol.

iii.NTP->PPi,PPi水解供能

e）geneexpression:

DNA->Functionalgeneproducts

✧Proteins

✧FunctionalRNAs:

ribosomalRNA（rRNA）,transferRNA（tRNA）,smallnuclearRNA（snRNA）,etc.

f）酶概念

i.Ribozyme=RNAenzyme，核酶

ii.RNase=Ribonuclease,核糖核酸酶

iii.i.≠ii.

I.转录Transcription

✓Eukaryote

✓Prokaryote

-InitiationComplex

-cis-factor（promoter）

Ø基本水平转录cis-factor:

corepromoter:

TATAbox,Inr.,capsite

UPE

Ø特异诱导高效表达cis-factor

Enhancer：

enhancerelement,enhanson,activator

增强特异性转录，无方向性，可远距离调控

-trans-factor:

transcriptionalfactors（GTF,etc.）

✡调控元件

·加强启动

Promoterproximalelement近启动子元件

Upstreamactivatorsequence,UAS上游激活序列

Enhancer

·阻遏型元件

Silencer

Insulator

a）Pre-Initiation（Eukaryote）:

染色质/核小体结构改变

b）Initiation

i.Polymerase

Prokaryote

Eukaryote

-onepol.transcriptallgenes

-pol.I:

rRNA

-pol.II:

mRNA

-pol.III:

tRNA,5srRNA,smallnuclearRNA

ii.Process:

✡RNAPbindspromoter

✡closedcomplex->opencomplex（bubble-12~14bp;RNA-DNAhybrids-8~9bp）

✡promoterescape（promoterclearance）:

formstablecomplex（DNA-RNA-pol.）

]stimulatedbyphosphorylationofCTDtailofRNAPII

]CTDcontains7肽重复（heptapeptiderepeat）:

Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser

]phosphorylation:

specifickinase,includeasubunitTFIIH

iii.initiationinvivo（体内）&invitro（体外）

InVivo

InVitro

Additionalenzymes（参见上文图）

Mediatorcomplex

Transcriptionalactivators

Chromatin-modifyingenzymes

RNAP

GTFs

iv.promoter:

✡corepromoter:

-35~-10

Rsite（-35box,TTGAC）:

RNApol.looselybindingsite,recognition

Bsite（TATAbox,TATAAT）:

Pribnowbox,pol.firmlybindingsite

Isite（+1,transcriptionstartingpoint-tsp）:

initiationsite,A/Grich.

-upmutation:

-35box&TATAbox>17bp

-downmutation:

-35box&TATAbox<17bp

✡upstreampromoter:

-70~-40

✡σfactor

]recognitionconsensussequenceofpromoter

]onlyrequiredforinitiation

]consensusseq.差异决定了σfactor与promoter的结合能力

]决定了strong/weakpromoter

v.abortiveinitiation/abortivetranscription

c）Elongation

i.process:

RNA~10nt->elongation,pol.conformationalchange

ii.function:

✡synthesisRNA

✡unwindDNAinfront

✡re-annealDNAbehind

✡dissociateRNA-DNA

d）Termination

i.process:

释放RNAtranscript

ii.terminator:

Prokaryote

Eukaryote

Rho-independentterminator（intrinsic）

-hair-pinstructure,反向重复回文序列

-GCrichhairpin

-polyUresidues

Rho-dependentterminator

-rhofactorbindtotranscript,pursuepol.

-formhairpin,pol.pauses.rhocatchup

-rhohelicaseunwindRNA-DNAhybrid,releasetranscript.

Difficulttoidentifytheprimarytranscriptionbecausethepre-mRNAprocessing

e）转录后加工,RNAprocessing

i.5’-endcapping

ii.3’polyAtail

✡process

]切断mRNA

]加上polyAtail

]终止转录

✡与转录终止过程偶联

✡pol.IIICTD参与招募多聚腺苷化酶polyAenzyme

✡转录产物上的polyAsignal促发polyA反应

i.&ii.作用：

✡防止RNA被exonuclease（核酸外切酶）降解，3’->5’or5’->3’

✡增强转录效率，翻译时供起始因子和核糖体识别

✡5’-cap协助mRNA转运到细胞质

✡分别与第一个和最后一个内含子切除有关

iii.splicing（removeintron）

ThreeclassesofRNASplicing

Class

Abundance

Mechanism

CatalyticMachinery

Nuclearpre-mRNA

Verycommon;mosteukaryoticgenes

2transesterification;

spliceosome

branchsiteA

GroupIIintrons

Rare;someeukaryoticgenesfromorganellesandprokaryotes

2transesterification;

RNAenzymeencodedbyintron（ribozyme）

branchsiteA

GroupIintrons

Rare;nuclearrRNAinsomeeukaryotes,organellegenes,andafewprokaryoticgenes

2transesterification;

RNAenzymeencodedbyintron（ribozyme）

exogenousG

外来G

✡剪切边界顺序

]GT-AG法则（Chambon法则）

]5’splicesite

]3’splicesite

]branchpointsite

✡

splicing机理：

两个连续的转酯反应（intronremovedinlariat）

spliceosome

]subunit：

snRNP（由5snRNA组成）

]5snRNA：

U1,U2,U4,U5,U6

100-300nt

richinU

snRNA（ribozyme）

]作用：

识别3’,5’-splicingsite&branchpointsite

将这些位点聚拢

催化或协助催化RNA剪切和连接

自剪切intron,Self-splicingintrons

]GroupIself-splicingintrons:

releasealinearintron

1sttransesterification:

afreeGisusedtoattackthe5’splicesite.2ndtransesterification:

theresulting3’-OHgroupatthe5’exonattacksthe3’splicesiteforthereaction.

特点：

✡smallerthanGroupII

✡shareaconservatory2ndstructure:

IGS

✡3rdstructurecontainsbindingpocket:

accommodateGornucleotidecofactor

]GroupIIself-splicingintrons

iv.甲基化

v.RNAediting

✡sitespecificdeamination,位点特异性脱氨反应

✡GuideRNA-directedUinsertionordeletion，gRNA指导的U插入或删除

II.翻译Translation

a）GeneticCode

i.rules

✡5’->3’,triplet（三联密码子）

✡nooverlappingandnogaps

✡fixedreadingframe:

startcodon

ii.特点

✡

结构

]

2ndstructure：

三叶草型，4arms，3loop，存在5arm-4loop

]3rdstructure：

L型

D环和TψC环形成了“L”的转角

AA距anticodonloop约70A

保守与半保守序列之间形成H-bond，L型

所有碱基平面之间碱基堆积力

]功能

{aaaccepterarm:

位于“L”的一端，契合于核糖体的肽酰转移酶（转肽酶）结合位点,以利肽键的形成

{anti-codonarm:

位于”L”另一端，与结合在核糖体小亚基上的mRNA的codon配对

✡通用性

]几乎所有生物公用一张遗传密码表

]共同起源

✡三联密码子

✡无标点

✡简并性，同义密码子，codonfamily

]简并机理：

31~40个tRNA识别61个codon，编码20AA

反密码子的5’-end,密码子的3’-end有摇摆性，wobbleposition

anticodon:

A,U,C,G,I（肌苷）

{拓扑结构：

34th摇摆点在L结构末端

碱基堆积力小

选择性配对自由度大

{34th位点被修饰频率高

配对原则的改变（A->I）：

I-A/I-C/I-U

34th几乎无A

✡nooverlapping

✡startcodon

]Bacteria:

AUG,UUG,GUG->甲酰甲硫氨酸fMet

]Eukarya:

AUG

✡stopcodon:

readbyreleasefactor（notbytRNA）

RF1,RF2,RF3（bacteria）&eRF1（eukarya）

UAA:

ochremutation赭石突变

UGA:

opalmutation蛋白石突变

UAG:

ambermutation琥珀突变

b）Mutation

i.错义突变

ii.无义突变

iii.移码突变

iv.抑制突变suppressed：

抑制突变抵消或抑制了前一次突变的效应。

v.回复突变reversed

c）mRNA

i.

Bacteria：

polycistronmRNA

✡结构

]多ORF（多编码序列）

]5’leadingseq.

]3’trailerseq

]spacer:

intergenicregion

✡RBS核糖体结合序列

]Shine-Dalgarno发现

]上游8-13nt的一段保守序列，嘌呤rich

]与16srRNA3’-end序列互补，促核糖体与mRNA结合,用来招募核糖体

ii.Eukaryote:

monocistronmRNA

✡5’-cap招募ribosome

✡ribosomescanningmodel，5’->3’,findAUG

✡polyAtail:

ribosomerecycling

d）AA连接在tRNA上

i.Process:

✡

氨基酸腺苷酰化=氨基酸活化

]ATP将AMP与AA的-COOH相连形成aminoacyl-AMP

✡tRNAcharging,tRNA加载

]

将活化的氨酰AMP与tRNA相连，形成氨酰tRNA，即chargedtRNA

ii.bindingsite:

✡AAsite

✡ATPsite

✡tRNAsite

iii.AminoacidsshouldbeattachedtotRNAtoformaminoacyl-tRNAviaahighenergyesterbondbeforeproteinsynthesis.

✡activateAA

✡bridgeAA&codon

✡高能酯键：

水解供能，肽键形成

iv.1个氨酰tRNA合成酶，对应一个氨基酸

✡对于该氨基酸的所有tRNA都公用这一个氨酰tRNA合成酶

✡基本上所有生物都有20个氨酰tRNA合成酶

v.核糖体不能区分tRNA是否携带正确的氨基酸

e）Ribosomestructure

i.核糖体结构与功能均决定于rRNAs

ii.有3个tRNA结合位点，A,P,E

✡Asite:

结合氨酰tRNA

✡Psite:

结合肽酰tRNA

✡Esite:

exitsite,空载tRNA离开的位点

iii.有1个mRNA通道和1个新生肽链通道

✡mRNAchannel:

mRNA进入和离开核糖体的通道位于小亚基30s

✡Peptidechannel:

新生肽链离开核糖体的通道位于大亚基50s

f）蛋白质合成机理

i.initiation

✡mRNA及起始氨酰-tRNA（甲酰甲硫氨酰-tRNA）与30S小亚基结合，然后50S大亚基结合形成核糖体

✡InBacteria

]

Process:

1.Formationofthe30Sinitiationcomplex:

IFs1-3+30S+mRNA+fmet-tRNAfMet+GTP

2.Formationofthe70Sinitiationcomplex:

50S+30S+mRNA+fmet-tRNAfMet

3.mRNA被招募：

RBS与rRNAbasepairing

4.fMet-tRNAfMet与小亚基结合

5.50s亚基和30s复合物结合

]Initiationfactors,IF

6.IF1：

加强IF2，IF3作用

7.IF2：

95-117kd,促使fMet-tRNA与30s选择性结合,GTPase活性

8.IF3：

20kd，促使30s亚基结合于mRNA起始部位，有解离30s与50s亚基的活性

]fMet处理（原核）

当新生肽达到15-16AA即发生

9.若N端为Met：

去甲酰化酶deformylase产生一个正常的-NH2末端

10.N端非Met：

氨肽酶aminopeptiase切除fMet

✡InEukarya

]核糖体识别5’M7G-cap

]以5’3’方向扫描的方式寻找起始密码子，一般是第一个AUG,Kozak序列可促进起始

]起始氨基酸为甲硫氨酸Met，而不是甲酰甲硫氨酸fMet

ii.elongation

✡核糖体沿着mRNA移动，肽链通过从肽酰tRNA转移到氨酰tRNA而延伸

✡新氨基酸加到延伸中肽链的C-端，方向N->C

✡肽键形成/转肽反应

]将延伸中的肽链从肽酰-tRNA转到氨酰-tRNA即形成新的肽键

]23srRNA是核酶，具有肽酰转移酶活性

✡延伸因子

]EF-Tu-GTP，EF-Ts

1.

与aa-tRNA结合

2.运送aa-tRNA至Asite

3.配对正确时，EF-Tu-GTP与factorbindingcenter作用,水解GTP

4.EF-Ts帮助EF-Tu-GDP回复活性（GDP->GTP）

✡Process

]进位反应：

氨酰-tRNA进Asite

]转肽反应：

肽键形成

]核糖体移位：

3base

✡蛋白质质量控制

]只有和密码子配对的氨酰-tRNA才能与rRNA形成稳定的接触

]不配对的氨酰-tRNA不能与rRNA形成稳定的接触，氨酰-tRNA从A位被逐出，不能形成肽键，GTP不被水解。

iii.termination

✡Process:

]RF释放peptide

]RRF进入Asite

]EFG推动RRF移位，解离最后一个tRNA

]EFG释放RRF，ribosome被解离

✡翻译到终止密码子，多肽链从tRNA上释放，核糖从mRNA上解离

✡释放因子releasefactor，bacteria:

RF1~3;真核:

eRF

]RFs识别终止密码子并与之结合，激活肽基转移酶，水解P位点上多肽与tRNA之间的键，释放多肽和tRNA

✡Ribosomerecyclingfactor,RRF

]EF-GandIF3acttorecycletheribosome

]ThesmallsubunitissequesteredbyIF3.

iv.蛋白质的合成能耗

每延伸1个aa

消耗的高能磷酸键

氨基酸活化

2个（ATP→PPi）

氨酰tRNA进位

1个（GTP→GDP）

核糖体移位

1个（GTP→GDP）

肽链起始

1个（70S复合物形成，GTP→GDP）

第1个氨基酸参入需消耗3个（活化2+起始1）

以后每掺入1个AA需要消耗4个（活化2个+进位1个+移位1个）

III.调控ControlofGeneExpression

a）参与调控的因子

i.signals:

小分子

ii.cis-factors:

operon，capsite，etc.

iii.trans-factors:

activator，repressor，TFs，σfactor，etc.

b）Regulator调控蛋白

geneexpressioniscontrolledbyregulator（regulatoryprotein）

extracellular/intracellularsignalcommunicatedtogenesbyregulator

i.PositiveRegulator:

activator

✡increasetranscription

✡activator结合DNA和RNAP，提高了RNAP对promoter亲和性，增强转录。

ii.NegativeRegulator:

repressor

✡decreaseoreliminatetranscription

✡与operator结合，覆盖部分promoter域，使RNAP不能结合，阻止转录

NegativeControl

Neginducible

Negrepressible

inducer

·

corepressor

·

repressor

·

·

Result

activate

repress

iii.Domains

✡DNAbindingdomain（DB）DNA结合域

]常见Motif

1.Helix-Turn-Helix

2.LeucineZipper

3.ZincFinger

4.Helix-Loop-Helix

✡protein-proteininteraction蛋白质互作位点

✡Effectorbindingsite效应物结合位点——小分子

]inducer

]corepressor

iv.参与调控的时机：

TranscriptionInitiation（Mostly）

✡最经济，最节省能量

✡调控最容易实现

c）操纵子

i.结构基因structuralgenes

ii.控制元件controlelements

iii.调节基因regulatorgenes

注：

一般不由同一promoter转录

iv.

e.g.乳糖操纵子lactoseoperon（正调+负调）

✡调控机理

]负调控

1.Repressor：

LacI

2.inducer：

allolactose

3.方式：

inducer结合LacI，使LacI脱开operator，开始转录

]正调控

4.CRP与cAMP形成complex，与上游调控元件CAPsite结合

5.激活转录

✡结构基因：

]lacZ：