专题2 微生物的培养与应用.docx

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专题2微生物的培养与应用

专题2微生物的培养与应用

一、课标要求：

（一）知识目标：

1、了解最基本的微生物技术（培养基的制备、高压蒸汽灭菌和干热灭菌、倒平板操作、平板划线操作和稀释涂布平

2、说明土壤中分解尿素菌的分离与计数的研究思路和实验设计

3、简述纤维素酶的种类及应用价值。

（二）能力目标：

1、掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌、平板划线法、稀释涂布平板法等基本操作技术。

2、运用相关技术解决生产生活中有关微生物计数、微生物的分离与培养等实际问题。

（三）情感态度与价值观：

1、领悟实验原理

2、体验实验操作

3、交流实验体会

4、培养学生良好的科学态度与习惯。

二、知识网络构建

三、复习策略：

1、本专题的3个课题中，课题1介绍了最基本的微生物技术（培养基的制备、高压蒸汽灭菌和干热灭菌、倒平板操作、平板划线操作和稀释涂布平板法），这些知识和技能是应用选择培养基分离某种特定的微生物（课题2和课题3）的基础。

本专题中所强调的无菌操作技术，还将有助于“专题3植物组织培养技术”的顺利完成。

因此，有关微生物技术内容是复习重点。

2、要理论联系实际：

①学法上应理论联系实际，在做中学是最有效的复习方法途径，②联系农业生产实际，如尿素分解菌、固氮菌、硝化细菌等与土壤中氮素的利用有关，且相互联系，相互利用。

更好地理解微生物活动与土壤肥力及农作物产量的关系。

③联系发酵生产中防杂菌污染，运用所学知识和方法去分离选择培养某种微生物。

④注重实验设计中应该遵循的原则：

本专题涉及的设置对照组、重复组、怎样选材、怎样做假设、怎样对实验结果进行预测和分析、尤其注重分析实验失败的原因。

四、重要考点归纳

（一）培养基：

不同的微生物需要采用不同的培养基配方，尽管培养基的配方各不相同，但是其基本成分都包括水、碳源、氮源和无机盐。

1、培养基的配制原则

①目的要明确:

目的包含两层含义，一指培养的微生物种类、二指培养的目的，是用于生产还是科学研究，因为二者对培养基的化学成分、物理状态等方面要求不同，例如用于生产的培养基应具有原料易得、价格低廉、配制方便等特点，而用于科学研究的培养基应具有成分含量准确，可多次重复实验的特点。

②营养要协调:

它表现在两个方面，一是营养物质的浓度要适宜，二是营养物质间的浓度比例要适宜。

③pH要适宜：

由于微生物在生长代谢过程中营养物质利用和代谢产物的形成往往会改变环境中的pH，为了维持培养基中出的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，最常用的缓冲剂是磷酸氢二钾或磷酸二氢钾。

2、培养基配制的程序及注意事项

计算→称量→熔化→调PH→灭菌→倒平板

①全程要求无菌操作，无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。

②培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。

可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

操作时使锥形瓶的瓶口通过火焰，通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

③平板冷凝后皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

④在倒平板的过程中，不能将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。

3、培养基的种类

按培养基物理性质划分:

名称

特征

功能

固体培养基

外观显固体状态的培养基

主要用于微生物的分离、鉴定

液体培养基

呈液体状态的培养基

主要用于工业生产

按培养基的化学成分划分

种类

特征

用途

天然培养基

用化学成分不明确的天然物质配成

主要用于工业生产

合成培养基

用化学成分已知的化学物质配成

主要用于微生物的分类、鉴定

按培养基的功能分

种类

制备方法

原理

用途

例

选择培养基

培养基中加如某种化学成分

根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基

使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选率

加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌

鉴别培养基

加如某种试剂或化学药品

依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计

鉴别和区分菌落相似的微生物

伊红和美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌

（二）微生物的纯化培养（两种接种方法）

1、平板划线法：

操作简单，但是单菌落不易分离

①无菌操作：

在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。

第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。

划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

②在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。

③由于划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

2、稀释涂布平板法：

操作复杂，但是单菌落易分离

①无菌操作：

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。

应从操作的各个细节保证“无菌”。

例如，对涂布器等接种器具进行消毒和灭菌、酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；②每一个稀释度下涂布三个平板作为重复组，不同稀释度下涂布的平板形成对照组，且每个平板所用的样液不超过0.1毫升。

③统计实验结果时注意选取菌落数介于30—300个之间的平板进行计数，且重复组结果要有相近性。

3、评价和分析实验结果

①培养基的制作是否合格

如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

②接种操作是否符合无菌要求

如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。

③是否进行了及时细致的观察与记录

培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。

（三）微生物营养

1、碳源

概念

凡能为微生物提供所需碳元素的营养物质

来源

无机碳源：

CO2、NaHCO3等

有机碳源：

糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油等

作用

①主要用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物

②异养微生物的主要能源物质

说明

不同种类的微生物，对碳源需要差别大

关于自养微生物和异养微生物碳源的利用和能量的来源

①自养微生物以CO2或碳酸盐为唯一碳源进行代谢生长；异养微生物必须以有机物为碳源进行代谢生长。

②异养微生物生命活动所需的能源主要依靠物质氧化分解放能，碳源是异养微生物的主要能源物质；某些异养微生物也可以光能作为能源，例如红螺菌，它不能以CO2作为主要或唯一碳源，而需要有机物参与，才能利用光能将CO2还原成细胞物质，这种营养类型称为光能异养型。

总结如下表

不同的微生物所需要的碳源不同

营养类型

能源

基本碳源

代表生物

光能自养

光

CO2

蓝细菌、藻类等

光能异养

光

CO2与简单的有机物

红螺菌科

化能自养

无机物

CO2

硝化细菌、硫细菌、铁细菌

化能异养

有机物

有机物

绝大多数细菌与全部真核微生物

③利用某些微生物碳源的特殊性解决环境污染、粮食危机等问题。

A、利用某些细菌、放线菌、酵母菌以石油作为碳源的原理，消除石油污染。

B、运用某些细菌可以分解、利用氰化物、酚等有毒物质的原理处理有害物质。

C、研究开发以纤维素、石油、CO2、H2等作为碳源和能源的工业微生物，解决工业发酵用粮与人们日常用粮的矛盾。

2、氮源

概念

凡能为微生物提供所需氮元素的营养物质

来源

无机氮源：

N2、氨、铵盐、硝酸盐等

有机氮源：

尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等

作用

主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物

说明

异养微生物：

含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源

关于氮源物质的来源和作用

①对许多微生物来说，既可利用无机含氮化合物作为氮源，也可利用有机含氮化合物作为氮源

②固氮微生物可以利用氮气作为氮源

③铵盐、硝酸盐等既可作为微生物最常用的氮源，也可作为某些化能自养微生物的能源物质；

④自养微生物与异养微生物类型的划分主要是依靠能否以CO2作为生长的主要或唯一碳源，而不决定于氮源。

（四）微生物的选择培养和鉴别培养

1、研究思路

（一）筛选菌株

微生物的选择培养，是指利用培养基的组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术。

在课题2提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的惟一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。

但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。

（二）统计菌落数目

统计菌落数目的理论依据是：

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。

为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。

教材中P22实例是为了说明设置重复组的重要性。

第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。

第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。

这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。

在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。

（三）设置对照

教材中P23实例是为了说明设置对照组的重要性。

A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。

一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。

究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。

实验方案有两种。

一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

2、课题成果评价

土壤中某样品细菌的分离与计数

①培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落

对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。

牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。

②样品的稀释操作是否成功

如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。

③重复组的结果是否一致

如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。

如果结果相差太远，需要分析产生差异的原因。

土壤中纤维素分解菌的分离

①培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落：

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。

如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

②分离的结果是否一致：

由于在土壤中细菌的数量