题目低温低光对铜绿微囊藻生长和光合活性响.docx

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题目低温低光对铜绿微囊藻生长和光合活性响

题目低温低光对铜绿微囊藻生长和光合活性响

单位铜山中学高一生物组

作者魏海慧

低温低光对铜绿微囊藻生长和光合活性的影响

摘要

运用正交实验设计方法研究了低温低光联合作用对铜绿微囊藻（MicrocystisaeruginosaFACHB905，以下简称905）生长与光合活性的影响。

采用植物效率分析仪（Water-PAM）测定了905细胞的光合活性，并通过回复培养验证了其光合作用回复的能力。

实验结果表明：

相对于正常培养条件，低温低光对M.aeruginosa的生长均有不同程度的抑制作用，在9℃各处理组中，M.aeruginosa基本无法生长，因此可推测905生长的温度阈值应高于9℃。

在12℃各处理组中，光强为影响905细胞生长的主要因子，12℃、2µE/m2s能促进其初期的生长，据此推测这一条件可能为微囊藻复苏的起始条件。

15℃各处理组中，905细胞在“微光”（2µE/m2s）处理组中电子传递速率及最大光量子产量高于“低光”（10µE/m2s）处理组，显示出相对于“低光”条件，铜绿微囊藻对“微光”的适应性更强。

而回复培养的数据显示，9℃，12℃处理组样品在5d内能迅速恢复其生长与光合活性，并最终与15℃处理组样品同样，稳定生长。

研究结果对解释铜绿微囊藻对湖泊底泥中越冬环境条件的耐受阈值及复苏的起始条件有重要意义。

关键词：

联合铜绿微囊藻阈值回复

Theeffectsoflowtemperature-lowlightonthegrowthandPhotosyntheticactivityofMicrocystisaeruginosa

Abstract

TheresponsesofgrowthandPSIIactivitiesinMicrocystisaeruginosa（FACHB905）hasbeenstudiedunderaconditionoflowlight-temperaturecombinationuseorthogonalexperimentmethod.ThePSIIactivitieswereassayedwithaWater-PAM,andalso,thephotosynthesisofM.aeruginosawasverifiedviarecultureunderanormalcondition.TheresultsshowedthatrecruitmentofM.aeruginosashouldnotbetriggeredsinceitcouldhardlygrowunderthetemperatureof9℃.Under12℃,thegrowthweregreatlyaffectedbythelightintensity.12℃&2µE/m2scombinationwasconsideredtobethethresholdvaluetoinducerecruitmentofMicrocystisduetothephysiologicalresponsesingrowthandphotosyntheticsystem.WealsofoundFACHB905couldpersistlongerunderlowlightintensity（2µE/m2s）thanarelativehigherintensity（10µE/m2s）under15℃,sincethechlorophyllcontent,electrontransferrateandyieldwererelativehigherincombination.RecultureofM.aeruginosawasconductedaftera-20d-studyfinished,samplesunderthetemperaturesof9℃&12℃recoveredsooningrowthcharactersandPSIIactivitiesduring5days,andreachedaratherstablegrowingstatuslikeothernormalculturedsamplesfinally.ThepresentresultsshouldbeimportanttodeterminethetolerancethresholdandeventorevealtheprobablemechanismsinoverwinteringandrecruitmentofM.aeruginosafromlakesediments.

KeyWords:

combination;Microcystisaeruginosa;thresholdvalues;recruitment

1.引言…………………………………………………………………………………………1

1.1蓝藻及蓝藻水华………………………………………………………………………2

1.1.1蓝藻概述………………………………………………………………………………2

1.1.2蓝藻水华及成因………………………………………………………………………2

1.2.铜绿微囊藻的形态特点…………………………………………………………………3

1.3低温低光对微囊藻生长的影响………………………………………………………3

1.3.1温度的影响…………………………………………………………………………3

1.3.2光照的影响…………………………………………………………………………4

1.4低温低光对微囊藻光合活性的影响……………………………………………………5

1.4.1温度………………………………………………………………………………5

1.4.2光照…………………………………………………………………………………51.5实验有关指标……………………………………………………………………………6

1.5.1叶绿色素a的测定……………………………………………………………………6

1.5.2光合活性相关指标……………………………………………………………………6

2.材料与方法………………………………………………………………………………7

2.1实验材料………………………………………………………………………………7

2.1.1材料……………………………………………………………………………………7

2.1.2主要药品试剂…………………………………………………………………………7

2.1.3主要仪器………………………………………………………………………………7

2.2实验方法…………………………………………………………………………………7

2.2.1超净工作台的使用……………………………………………………………………7

2.2.2BG-11培养基的配制…………………………………………………………………7

2.2.3M.aeruginasaFACHB905的扩大培养……………………………………………8

2.3藻的生物量………………………………………………………………………………9

2.3.1叶绿素a测定…………………………………………………………………………9

2.3.2藻的光合活性的测定………………………………………………………………9

3.研究结果…………………………………………………………………………………10

3.1M.aeruginasaFACHB905的生物量的变化……………………………………………10

3.2低温低光条件下光合活性的变化……………………………………………………10

3.2.1荧光量子产量（Yield）……………………………………………………………10

3.2.2电子传递速率（ETR）………………………………………………………………10

3.2.3最大可变荧光（Fv/Fm）……………………………………………………………10

4.回复实验…………………………………………………………………………………12

5.讨论与分析………………………………………………………………………………13

5.1低温低光对M.aeruginasaFACHB905生长的影响…………………………………13

5.2低温低光对M.aeruginasaFACHB905光合活性的影响………………………………14

6.结论………………………………………………………………………………………15

参考文献……………………………………………………………………………………16

致谢……………………………………………………………………………………………19

1.引言

近年来，随着水体富营养化的日益加剧，蓝藻水华频繁发生，其中尤以微囊藻水华最受关注。

Reynoldsetal通过对微囊藻生活史的研究发现其细胞存在越冬、复苏、暴发水华及沉降四个不同的阶段（Reynolds,1981），孔繁翔等人的研究也证实了水华发生四阶段理论的存在（孔繁翔,阎荣,韩小波,2003）。

目前研究表明，微囊藻的复苏可能受一系列理化、生物、水文和气象因素的影响，其中光照、温度、溶解氧及营养盐等被认为是影响藻类复苏的重要环境因子。

。

吴晓东等人对比了太湖和巢湖的蓝藻越冬及复苏过程，发现水体营养盐浓度对这一生活史过程无显著影响（吴晓东,孔繁翔,张晓峰,2008），而最新研究结果表明，沉积物的性状对滇池微囊藻复苏影响较大（万能,汤俊,李林等,2009）。

目前，针对不同环境因子对微囊藻复苏影响的模拟研究较多，由于微囊藻时空分布的不同，复苏所需温度不尽相同，多数学者认为复苏起始温度应在10℃左右；而对于微囊藻复苏所需光强阈值的研究并无定论，国内外专家较多的关注于底泥黑暗环境下的模拟研究，对于弱光照度影响藻类复苏的研究甚少。

复苏的影响因素是多方面的，而低温低光条件是铜绿微囊藻越冬及复苏过程中必须经历的环境条件,目前对低温低光共同作用下，铜绿微囊藻的生理响应的研究较少,因此对这一领域的探索性研究有利于揭示水华种源越冬及复苏的生物学机制，对水华暴发的初期进行预测预警也有积极的指示作用。

1

1．蓝藻及蓝藻水华

1.1蓝藻概述

蓝藻（blue-greenalgae）蓝藻又称蓝绿藻，或称蓝细菌，没有细胞核但是具有真核生物中进行光合作用的主要色素叶绿素a，并在光合作用中释放出氧气（孔繁羽，2007）,包括有两个光合系统（Carr&Whitton，1982），是一类能够进行光合作用的最原始的原核生物，在分类学上隶属于蓝藻门（Cyanophyta），蓝藻化石证据表明，蓝藻可能是地球上最早进行放氧光合作用的生物（Wilmote，1994）。

蓝藻形态各异，通常按形态可分为单细胞、无分支和分支丝状体，一些丝状体种类具异形胞（heterocysts）（Tandeau&Houmard，1993）。

1.1.2蓝藻水华及成因

水华，亦称水花（water-bloom）,通常是指淡水池塘、河流、湖泊、水库等水体受到污染，氮、磷等营养物质大量增加，致使水体富营养化或严重富营养化状态，在一定的温度、光照等条件下，某些藻类发生爆炸性的繁殖，引起明显的水色变化，并在水面形成或薄或厚的绿色或其它颜色的藻类的漂浮物现象（周云龙等，2004）。

一般藻细胞浓度达到20000个/ml，则认为发生水华（SchynsG,JiaL,CoursinT,1995），一般认为水华的发生首先是水体中的营养物质（如氮、磷等）过量增加，致使水体达到富营养化状态，这是水华现象的最重要的物质基础。

（金相灿等，1990）。

水华已经成为全球性环境问题。

（Carmichael,1994）。

目前，除南极洲外的世界六大洲都曾报道过水华的暴发。

水华可由一种或多种藻类组成，在我国绝大多数富营养化水体中发生的是微囊藻水华，例如滇池、太湖、巢湖等大型湖泊，而其中又以铜绿微囊藻（Microcystisaeruginosa）占绝对优势。

微囊藻之所以能形成优势种水华是与它自身特殊的结构特点与生理特性是密切相关的：

首先在结构上，微囊藻细胞壁外被胶质鞘，由于有这层胶质鞘，尽管微囊藻体内蛋白质高达49.7%，生物可利用性也受到极大的限制；其次在微囊藻细胞内部有一种特殊的伪空胞结构，可调节身体在水体中的浮力，使身体在水层中发生垂直移动，这种活动具有一定的昼夜节律性和季节节律性（孙慧群等，2005），从而获得最有利于生长的光照强度（ReynoldsCS,OliverRL,WalsbyAE,1987，OliverRL,GanfGG.2000）。

微囊藻生长与形成分为4个阶段:

休眠、复苏、生物量增加和上浮、形成水华，其中生物量增加和上浮是水华爆发的关键阶段，这一阶段很大程度上取决于伪空胞的功能，第三，微囊藻能分泌一种酸性多糖物质到体外，并形成厚厚的胶被，胶被的增加使细胞群体随之变大，有效增强其对浮游动物牧食的抗性，并且胶鞘为微囊藻细胞提供了低氧化还原的微环境（SirenkoLA,1972），使微囊藻避免环境中的高浓度氧的危害（GusevMV.1962，SirenkoLA,1969），第四，微囊藻具有高效吸收利用外源无机碳的机制―二氧化碳浓缩机制（ShapiroJ,1973）。

第五，微囊藻的次生代谢产物微囊藻毒素（microcystins）能抑制其它藻类（Huetal.,2005）甚至某些高等植物的光合作用（Abeetal.,1996），此外当外界环境不利于生长时，微囊藻会发生沉降或者通过越冬机制而适应恶劣环境，以上的这些生理特性都决定了微囊藻能在自然水体中生存并成为优势种群。

1.2铜绿微囊藻的形态特点

铜绿微囊藻（Microcystisaemginosakutz）属于蓝藻门，色球藻目色球藻科微囊藻，是占藻类绝对优势的种类，干燥寒冷的气候条件促使铜绿微囊藻通过形成孢子来越冬，到了初春季节才开始萌发。

它的幼期是一种球形、亚球形或长筒圆形而中实的藻体，胶囊不明显；成长的群体多分裂成网状或窗格状，群体团块肉眼可见，呈橄榄绿色或铜绣绿色；成体除有明显的群体胶囊外，各个细胞还有自身的胶囊，这种胶囊呈圆形或多角形。

（董耐成，2002）

1.3低温低光对微囊藻生长的影响

1.3.1温度的影响

温度是促进藻类生长最基本的环境因子（孙慧群,朱琳,高文宝.,2005），10℃下微囊藻可以维持7d的缓慢生长,之后生物量快速下降（李杰，2008），中科院利用滇池湖水所做的“温度对微囊藻生长影响”试验显示在秋季随着水温下降，微囊藻生长繁殖减缓，15℃以下微囊藻停止生长繁殖（RobartsRD,ZoharyT.Temperatureeffectsonphotosyntheticcapacity,respiration,andgrowthratesofbloom-formingcyanobacteria.NewZealJMarFreshwatRes,1987,21（3）:

391-399.），另有研究表明对于水华微囊藻，其生长速率在10-28℃范围内随温度升高而增大，当温度低于13℃时，细胞生长停止，当温度达到16℃时，细胞开始缓慢生长，当温度达到20℃时，微囊藻生长较快（金相灿，2008）。

温度与藻类复苏有很大的影响，所谓复苏是指蓝藻中的微囊藻在生长环境不利时会在底泥表面积累，进入休眠状态，等到环境条件适宜时，开始生长，迁移到水中的现象。

冬季里藻类处于休眠状态，Thomas&Walsby认为当温度上升到7℃左右时，微囊藻在湖泊底泥表面开始缓慢生长（ThomasRH,WalsbyAE,1986），Reynolds（1973）提出，当水体的温度达到7-8℃时，微囊藻群体在底泥中开始初期缓慢的生长；微囊藻群体在15℃时，生长速率增大，并且开始少量地迁移至水体中，李阔宇证实微囊藻在底泥中开始生长所需要的最低温度为10℃，当温度上升到15℃时，底泥中的微囊藻群体开始从底泥中释放进入水体，在20℃时大量释放进入水体。

而陶益（2005）等以采自太湖的底泥中微囊藻作为研究对象，发现底泥中微囊藻进入水体的最适温度为18~20℃，因南北的地理因素不同，复苏所需的温度也不相同，但是基本都是在10°C左右，且当温度继续上升到15°C以上时，它们开始向上进入水柱中生长（万能，2008）。

铜绿微囊藻是南湖湖水体中盛夏季节最常见的、占藻类绝对优势的种类。

一般以无性繁殖为主，进行细胞分裂、植物体分割和孢子形成等。

当环境条件适宜、营养丰富时，藻类以细胞分裂的方式增加藻类个体数目的速度是很快的，但是入冬，北方干燥寒冷的天气及营养不足等不利条件促使铜绿微囊藻通过形成孢子来进行越冬，到了初春季节才开始萌发。

孢子在细胞内形成的，先是核的分裂、随着是细胞质的分裂，结果在一个母细胞内产生2，4，6，8......个小细胞，即孢子。

董耐成在铜绿微囊藻越冬孢子萌发研究的实验中，通过设置不同的温度来探讨孢子萌发与温度的关系，从实验中我们发现：

于不同温度下（8，10，12，14，16，20℃）经过12天的培养，南湖冰下水体中的越冬孢子数由原来的80％以上，降到5．0％以下。

试验表明：

当营养条件和其它环境条件充分时，温度因子可以刺激藻类越冬孢子的萌发。

但是温度不同，孢子萌发规律有所差异。

从12℃开始，一直到20℃，孢子萌发速率明显比8℃和10℃时的萌发速率快，前者在4日之内孢子减少了50％以上，而后者则在15％以下，因而当南湖实际水温达到10～12℃时，至少在4日之内，应及时采取杀藻措施，以达到有效杀藻，防止“水华”发生。

另外，如果在湖体解冰前，孢子尚未萌发之际，将孢子数消灭至最低限，也可以起到防息于未然的效果。

能否早日解决这些问题，也是彻底解决湖泊富营养化问题的关键（徐锐贤，1999）。

1.3.2光照的影响

1.3.2.1光照强度的影响

光照是是影响藻类生长繁殖的重要的生态因子之一，也是其生长的主要能量来源。

在一定pH、温度和营养条件下，光照的强弱和时间的长短决定着单细胞藻类光合作用的效率，对藻类的生长速率亦起着至关重要的作用（吴旭，2008）。

在BG-11培养基中,光照度4300lx最适宜铜绿微囊藻生长,这与林毅雄等在自制培养基以及灭菌滇池灰弯湖水中培养铜绿微囊藻的试验结果相近（4000~5000lx之间μ最高）.当光照度＜4300lx时,随着光照度下降,铜绿微囊藻生长趋势减缓;当光照度≤470lx时,铜绿微囊藻生长受到明显的抑制，μ值显著下降,不到4300lx时的50%;光照度≤120lx时,μ则为负值,藻细胞密度呈衰亡趋势（陈雪初，2007）。

刘玉生（1995）指出在1000~3200lx范围内，光照对藻类的影响较大，在3200lx左右，增殖速率最大。

以此为转折点，藻类增长曲线后部趋于平缓，说明3000lx是最适宜的培养光照。

当光强处于较弱光强500lux时,铜绿微囊藻的生长速度慢,低光照度能对铜绿微囊藻增殖起到抑制作用.（张丽霞，2009）。

1.3.2.2光谱成分的影响

微囊藻在白光下的生长速率最快，可见白光对藻的细胞生长有明显的促进作用，而红光和蓝光对藻的光合作用有促进作用，能积累更多的光合产物和干物质，所以其叶绿素含量较高。

1.4．低温低光对微囊藻光合活性的影响

1.4.1温度

叶绿素分子通过直接或间接吸收光量子得到能量后，从基态跃迁到激发态，处于激发态的叶绿素分子通过释放能量回到稳定的基态，当它释放出一个光子回到基态，即产生荧光（万能，2008）。

植物叶绿素荧光在许多研究中被用作评价光合作用过程和不同环境因子对光合能力影响的指标，叶绿素a荧光的可变部分（Fv）与最大荧光（Fm）的比值可显示光系统Ⅱ的光化学效率，是使用最广、使用频率最高的一个参数。

在正常生理条件下，它是一个稳定的值，藻类一般为0.65（Kolberetal.,1988）。

在正常条件下该参数变化极小，不受物种和生长条件的影响，逆境下该参数明显下降。

当微囊藻群体被从适宜的生长温度转移至低温（<15℃）时，Fv／Fm的比值降低，说明光系统Ⅱ的光化学效率降低,微囊藻群体长期处于低温环境中，光系统Ⅱ受到一定的损伤，但仍然具有活性，当环境改变，对生长有利时，光系统Ⅱ的活性开始恢复（李阔宇，2004）。

梁英（2008）指出温度为5～20℃时,各荧光参数与温度的相关性与培养天数有关,培养天数为1～5d时,三角褐指藻的Fv/Fm与温度呈极显著的正相关关系；培养天数为1～4d时，ETR与温度也呈显著的正相关关系；培养天数为8~10d时，Fv/Fm、ETR呈显著的负相关关系。

温度为20～30℃时,在整个培养周期中,三角褐指藻的荧光参数ETR与温度呈显著的负相关关系;培养天数为1～5d和9～10d时,Fv/Fm与温度呈显著的负相关关系。

1.4.2光照

当藻类处于不适宜的光照强度时，光系统就会受到不同程度的损伤，从而造成光合能力的下降，一般认为，当光强低于半饱和光照强度时，光损伤会明显加剧（陈莲花，2007）。

自然环境的光强范围内（6.5~2000μmol·m-2·s-1），藻类光损伤速率与光强呈直线关系（Tyystjärvi&Aro，1996）。

光损伤在所有光照条件下都会发生，低光下也不可避免，不同的是其发生的光损伤机制不同于高光下的受体侧损伤，是一种供体侧损伤，也称之为“低光综合症”（low－lightsyndrome）（Ohadetal.,1994;Kerenetal.,1995，1997）。

此外，Krause（1994）认为低温还能加剧光损伤，也有研究认为（Sakamoto&Bryant，1998）低温对藻细胞生长的影响并不是由光合作用抑制引起，而可能是由于营养缺乏引起的，低温下营养缺乏可能会损害其多种生理活动。

当光强处于10μmol·m-2·s-1与40μmol·m-2·s-1时，Fv/Fm的值均比较高，一直保持在0.45左右，说明此光照条件下有利于微囊藻的生长。

与此相反，在光强320μmol·m-2·s-1条件下，铜绿微囊藻的Fv/Fm值第1天就显著降低，至第4天起才稍微升高，说明强光显著影响了铜绿微囊藻PsⅡ的原初光能转化效率。

当光强处于160μmol·m-2·s-1时铜绿微囊藻PsⅡ的原初光能转化效率也明显降低。

较弱的光强500lux虽然对叶绿素荧光参数Fv／Fm没有影响,但是却影响了藻的光合速率（张丽霞，2009），说明在不同光强下，铜绿微囊藻叶绿素荧光参数均有明显的变化．

1.5实验有关生理指标

1.5.1叶绿素a的测定

采用80%的丙酮提取，比色法测定。

取样品（Va=10mL）于l0mL的离心管中，经4000r/min离心15min，弃上清液，下层藻体重新悬浮于80%丙酮（Vm=3mL）中，密封后于4℃、黑暗条件下储藏过夜；再经4000r/min离心15min，取上清液，以丙酮作为参比液,分别测定上清液在646nm和663nm下的吸光值,单位：

mg/L

chl.a（mg/L）